תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
הוא קבע כי תנועתיות של תאים הסרטניים היא חזויה של פוטנציאל גרורתי, בהתחשב בעובדה שהתנהגות כזו מאפשרת פלישה דרך הקרום במרתף והכניסה למערכת דם 1. רוב המחקר על תנועתיות התמקד בדרך בה התאים מתנהגים בסביבה דו-ממדית (2D), אם כי זה הופך להיות מוכר באופן נרחב שהתנועה של תאים במטריצה תלת-ממדי (3D) הוא נציג נוסף של איך אותם תאים יהיו ממש להתנהג בvivo 2. מערכות תרבות 3D משמשות יותר ויותר ללמוד התנהגויות סלולריות הנעות בין מורפולוגיה תא, לקינטיקה צמיחה ורגישות לסמים 3. הרצון לפקח על פלישת תאים סרטנית בהקשר של סביבת 3D הוביל לסינתזה של טכניקות הוקמו בעבר מעורב הדור של אגרגטים 3D תא (spheroids) באמצעות שיטת הטיפה התלויה תרבות 4, ואחרי הטבעת spheroids אלה לתאיים 3D מטריקס (ECM) מורכב מחומרי קולגן וקרום במרתף 5. שיטה זו נועדה לשפר את ביצועי טכניקות הוקמו בעבר אלה על ידי מתן גישה יעילה שיכול להיות מנוצלת בקלות להשוות פלישה תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי.
דרכים מסורתיות יותר להעריך תנועתיות תא במבחנה הן assay-פצע השריטה וassay transwell 6. Assay לשעבר מתאר תנועתיות תא בהגדרת 2D, ולכן אינו תלוי של מגוון רחב של תכונות קריטיות לפלישת in vivo, למשל פעילות פרוטאז 7. Assay transwell יכול פלישת תא מודל טוב יותר כאשר מוסיף גם הם מצופים עם מצעי ECM אבל, רק פרמטר אחד, כלומר את המראה של תאים על פני השטח הקרום ההפוך נמדד, וניואנסים רבים של פלישת תא לכן אינם ניתנים לצפייה בקלות. בניגוד לשיטות אלה, assay פלישת אליפטית תאים הסרטניים (איור 1 </ Strong>) מאפשר לניטור בזמן אמת של פלישת תא בהגדרה שהיא לא רק מבחינה פיזיולוגית רלוונטי, אלא גם מאפשר תכונות חשובות תא קו ספציפי להיות דמיינו, כגון תא בודד מול קולקטיבי הגירה 8. שיטה זו גם מאפשרת יתרונות על פני מבחני צמיחת תרבות 3D סטנדרטיים. הדור של אגרגטים סלולריים באמצעות שיטת הטיפה התלויה בתחילה מגביל תנועת תא, כך שתאים יהיו תמריצים לפלוש לאחר אילוץ זה יוסר. יתר על כן, ברגע שהאילוץ שהרים, היציאה תא תמשיך בכיוון אחיד, כי אז יכול להיות ונרשמת בנוחות.
חומרי ECM הפופולריים ביותר המשמשים למבחני spheroids תא סרטני הם Matrigel וסוג אני קולגן, שבו כל אחד ממרכיבים אלה יש תפקידים חשובים ומובהק בהשפעה על התנהגות גרורתי. Matrigel הוא תערובת של חלבונים מופרשים מיוצרים על ידי תאי סרקומה Engelbreth-הולם נחיל עכבר, והוא מועשר בbasemeחלבוני קרום NT כגון laminin, entactin, וקולגן IV סוג 9. מסיבה זו Matrigel נקרא מעתה ואילך ל" חומרי קרום במרתף. "חומרי קרום במרתף אלה מספקים ligands החיוני נחוץ לintegrin הידבקות במהלך פלישת תאים סרטני 10 בנוסף לחלבונים רבים אחרים שמפעילים מגוון רחב של השפעות על התנהגות תא 11. לשם השוואה, הסוג אני קולגן, מוכן בדרך כלל ממעכלים חומצה של גידים ומבני collagenous צפופים אחרים 12, הוא חומר מטריצה הרבה יותר פשוט, המשמש כמרכיב מבני עיקרי של רקמות חיבור רקמות וסטרומה תמיכה ואיברי הגוף. הוכח שהמאפיינים הפיזיים של קולגן יכולים לווסת מספר התכונות של תנועתיות תא; לדוגמא, את היישור של סיבי קולגן בממשק הגידול-סטרומה מאפשר לתאי סרטן להגר לאחר מכן לאורך סיבים שבהם פולשים לתוך סטרומה 13. בassay שהוצג כאן, שניהם הסוג אני קולגן וחומרי קרום במרתף משמשים ככלים ללמוד אינטראקציות התא-סטרומה סרטן 3D.
ההשפעה של עיכוב או גירוי של מסלולים השולטים פלישה ניתן לנטר אחרי התאים כבר מוטבעים במטריצת 3D. ניתן pretreated תאים במהלך צמיחה בטיפי התלייה או על העברה לתרבות 3D, תלוי אם יידרש טיפול ממושך לווסת פלישה. לטיפולים קצרים יותר, מומלץ כי התרופה להיות מעורבבת עם ההשעיה אליפטית לאחר איסוף, כמו גם התקשורת שמקיפה את תרבויות 3D, כדי להקל על חשיפה לסמים נאותה לתאים. לאחר מכן, ניתן ונכללו תאי סטרומה רגילים או גידולים הקשורים עם חומר המטריצה להעריך את תפקידם בויסות פלישת תאים סרטניים, או כדי לקבוע כיצד השפעות איתות התנהגות תא אוטוקריני וautocrine. רעיון זה הוצג במחקר שבו coculture של colעל סרטן ותאי האנדותל בטיפות תלויות הוביל לרשת כלי דם בתוך spheroids 14. לבסוף, ניתן גם לשנות את מרכיבי ECM, כמו הפלישה של תאי הסרטן מושפעת מצעים שונים 15. כך השיטה המובאת להלן תספק מסגרת להערכת פלישת תאים סרטניים תחת מגוון רחב של תנאים. באופן כללי נמצא כי לא כל שורות התאים ייצרו spheroids בטיפין התלויות ושורות תאי אפיתל מראה בדרך כלל יוצרות כדורים רגילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה העריך את הביצועים של פנל של שורות תאי הסרטן בassay אליפטית פלישה (טבלה 1). בדרך כלל, אנו מוצאים כי היווצרות אליפטית מוגברת בשורות התאים יותר למראה אפיתל, שבו נוכחותו של צמתים תאי תאים מקדמת את הקמתה של ארכיטקטורה כמו-אליפטית. קווים ידועים תא שעברו מעבר אפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי CA051008 P30 מענקי NIH וT32 CA009686 (ATR).
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
