Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Summary

Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l'expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

micro-organismes probiotiques sont des moyens potentiels intrigants de manière efficace et économique la prestation protéines hétérologues dans le tractus gastro-intestinal. Ces organismes sont capables de survivre passage à travers le tractus gastro-intestinal pour l'instant ne coloniser ^1, ce qui permet un dosage contrôlé et en limitant l'exposition au médicament exprimé. En outre, la capacité de construire facilement ces organismes pour produire une protéine hétérologue à grande échelle les rend une alternative économique aux particules de livraison synthétiques. Cependant, le développement d'une telle approche, comme l'a montré récemment l'aide d'une souche auxotrophe de la levure Saccharomyces probiotiques boulardii ^2, nécessite la connaissance des techniques de laboratoire ne sont pas traditionnellement associés au sein d'une étude donnée, allant de la levure et de la biologie moléculaire pour les techniques de manipulation des animaux et des méthodes immunologiques. Ainsi, bien que les procédures individuelles décrites ici ne sont pas en eux-mêmes nouveauxles protocoles de laboratoire, le but de ce manuscrit est de présenter une introduction unifiée pour les techniques nécessaires pour les tests expérimentaux de la levure probiotique en tant que véhicules de délivrance de médicaments à l'appareil gastro-intestinal murin. Fourni est une compilation des protocoles essentiels pour: 1) la génération de souches mutantes auxotrophes de levure qui peut facilement être génétiquement manipulés; 2) la transformation de cultures de levure pour exprimer une protéine hétérologue; 3) l'administration de levure recombinante à l'intestin par gavage; et 4) la récupération de viable levure probiotique recombinant de l'intestin de souris et l'évaluation de leur expression de la protéine hétérologue.

En premier lieu, bien que de nombreuses méthodes de sélection positive et négative existent pour la manipulation des espèces de levures, de sélection négative tel que par l'utilisation de marqueurs auxotrophes augmente à la fois l'efficacité et la facilité avec laquelle la levure peut être transformée et sélectionnée. sélection positive des transformants en utilisant des antibiotiques, en collaborationntrast, augmente considérablement le coût de la manipulation de levure. En outre, la sélection de la levure sur un milieu solide contenant antibiotiques peut permettre d'accroître la croissance de colonies de fond non transformées par rapport à la sélection de la levure auxotrophe sur une chute de synthèse sur milieux solides (observations non publiées). levure auxotrophe est souches qui manquent d'enzymes essentiels pour la synthèse des acides aminés essentiels ou uracile. Cette levure peut se développer que si elle est complétée avec le métabolite manquant ou gène métabolique, permettant ainsi une sélection négative lorsque la levure est plaquée sur chute de synthèse sur les médias qui manque le métabolite essentiel. Beaucoup de Saccharomyces souches couramment utilisées en laboratoire cerevisiae sont en fait déjà mutants auxotrophes ^3. souches de levures probiotiques industrielle, cliniques et, cependant, sont généralement prototrophe avec la capacité de synthétiser tous les éléments nutritifs nécessaires. Pour permettre la manipulation génétique plus efficace de cette levure, gènes auxotrophes peuvent être ciblés de façon sélectivepour générer des souches qui peuvent être sélectionnés sans antibiotiques. Un ciblage spécifique des gènes marqueurs auxotrophes peut être obtenue par disruption génique médiée par PCR reposant sur ​​la recombinaison homologue ou, plus récemment, par le biais CRISPR / cas9 ciblage ^4-6. Alternativement, la mutagenèse UV peut générer rapidement des mutants auxotrophes même dans des souches de levure pour lesquels la transformation avec de multiples plasmides est techniquement difficile ^7. Bien que le ciblage PCR et CRISPR / cas9 ont été décrits en détail ailleurs, présenté dans la première partie de ce manuscrit est un protocole détaillé décrivant une approche de mutagenèse UV pour créer des souches auxotrophes qui permettront de sélection négative plutôt que de sélection antibiotique positif de transformants de levure.

L'étape suivante nécessaire à l'utilisation de telles souches auxotrophes pour l'administration orale de la protéine hétérologue est une levure transformation avec de l'ADN plasmidique. Depuis la première transformation réussie de yeast sphéroplastes déclarés pour Saccharomyces cerevisiae en 1978 ^8, de nombreuses modifications ont été caractérisées pour accroître l'efficacité et la facilité avec laquelle les espèces de levure peuvent être génétiquement modifiés. Utilisation d'électroporation pour la transformation réussie de l'ADN dans S. cerevisiae a été décrite la première fois en 1985 et ⁹ a depuis été améliorées par l'addition de 1 M sorbitol incubation à osmotique des cellules de soutien ^10. L'efficacité d'électroporation a été démontré en outre dépendre de l'espèce de levure et de la souche, le nombre de cellules et la phase de croissance, le volume d'électroporation, l'intensité du champ, et des tampons spécifiques ^11. Lithium acétate (LiOAc) transformation, initialement décrite par Ito et al. ^12, est parmi les protocoles de transformation les plus couramment utilisés car il ne nécessite aucun équipement spécial. Des analyses complémentaires ont montré que l'efficacité de transformation de la levure LiOAc augmente considérablement lorsque les cellules sont recueillies dans la phase mid-logde l'évolution et sont un choc thermique en présence de polyéthylène glycol (PEG) et de l'ADN à 42 ° C ^12. Incubation de levure intactes ensemble avec le PEG est essentiel pour la transformation efficace, peut-être par l'amélioration de la fixation de l'ADN sur la membrane cellulaire, ainsi que par d'autres effets sur la membrane ^13. Lithium soi augmente également la perméabilité des cellules intactes ^14. Bien que la plupart laboratoire S. souches cerevisiae peuvent être facilement transformées en utilisant LiOAc transformation ^trois, d'autres espèces de levure peuvent être plus efficacement transformés en utilisant des protocoles alternatifs. Pichia pastoris, par exemple, est le plus efficacement transformé par électroporation plutôt que LiOAc transformation ^13. Il est donc essentiel de tester multiple méthodes de transformation et d'optimiser les périodes d'incubation et les concentrations de réactifs lors de la tentative de modifier génétiquement une souche de levure non caractérisée. Ce manuscrit décrit ainsi à la fois LiOAc transformation et l'électroporation que des techniques pour la transformation de mutant auxotrophe et de type sauvage S. boulardii. Les lecteurs intéressés sont dirigés vers derniers avis sur descriptions approfondies de l'évolution de la transformation de la levure, d'autres protocoles, et d'autres discussions sur les mécanismes d'action possibles ^13,15. Transformation de la levure avec le plasmide codant pour une protéine facilement détectable est en outre essentiel pour les tests en aval, afin d'assurer l'expression et la fonction de la protéine hétérologue appropriée. protéines différentes Myriad peuvent être choisis en fonction de la finalité de l'étude thérapeutique et les anticorps disponibles pour la détection de protéines par immunoblotting, ELISA, et d'autres techniques. Les protocoles pour ces techniques ont été décrites en détail ailleurs ^16,17, et peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux de production de protéine hétérologue de la levure transformée par comparaison avec des courbes d'étalonnage. Pour des fins de démonstration et de montrerproduction réussie d'une protéine très couramment utilisé dans la levure biologie, ce manuscrit présente transformation avec la protéine de plasmide codant pour fluorescente verte (GFP), ce qui permet une détection ultérieure en utilisant la microscopie de fluorescence.

Tout aussi important pour la production d'organismes probiotiques qui expriment la protéine hétérologue est la bonne administration et la détection de ces micro-organismes dans les tissus gastro-intestinaux, comme il est décrit dans les parties trois et quatre. L'administration de levure recombinante par gavage par voie orale permet de réceptionner des quantités contrôlées de levure directement dans l'estomac, à partir duquel souris C57BL / 6 sont naturellement incapables de ¹⁸ vomissements. Cependant, la manipulation des animaux impropre et gavage peuvent entraîner des lésions de l'œsophage et de perforation, perforation gastrique, l'administration de la trachée, et une pneumonie par aspiration ^19,20. Une mauvaise technique et l'inexpérience peuvent en outre augmenter la variabilité dans les réponses immunitaires murines et resu expérimentaleLTS, qui ont été attribués au stress des animaux lors de gavage oral ^21,22. Pratique dans la bonne technique peut donc non seulement atténuer l'inconfort des animaux, mais peut aussi augmenter la précision des résultats expérimentaux. Ce manuscrit décrit et démontre la manipulation des animaux et gavage oral pour l'administration des doses contrôlées de levure recombinante.

Enfin, il est essentiel de confirmer la livraison réussie de levure recombinante en analysant les tissus lymphoïdes de la présence de la levure et de la protéine hétérologue. Les tissus immunitaires gastro-intestinaux qui peuvent plus facilement et de manière prévisible être examinés pour déterminer la présence de la levure sont les plaques de Peyer. Les plaques de Peyer sont des organes lymphoïdes secondaires le long de l'intestin grêle qui sont les principaux sites de muqueuses induction de la réponse immunitaire ^23. Les antigènes de la lumière sont transmis à travers transcellularly microfold (M) des cellules de l'épithélium et sont libérés dans les plaques de Peyer, exposant ainsi enfermerd cellules présentant l'antigène à intestinale au contenu de la lumière. Bien que l'absorption des particules à travers l'épithélium intestinal peut également être réalisée par les cellules caliciformes, ces cellules ont été représentés pour ne prendre que des particules inférieure à 0,02 um de diamètre ^24. Dendrites transépithéliaux étendus à partir de cellules dendritiques CD103 ⁺ (DC) prennent également de petites particules à partir du lumen intestinal ^25; cependant, il n'y a pas de rapports démontrant que CD103 ⁺ DC prennent des particules plus grosses que les bactéries. Ainsi, la levure probiotique intact, de taille moyenne comprise entre 3-6 um de diamètre, sont plus susceptibles d'être absorbé par les cellules M et transféré dans les plaques de Peyer. Décrit ici est un protocole pour la collecte et le dépistage des plaques de Peyer de levure recombinante viable, bien que cette procédure peut également être facilement adapté pour évaluer l'absorption de bactéries probiotiques.

En résumé, l'évaluation de la levure probiotique recombinant pour la livraison de laprotéines thérapeu- à l'intestin nécessite la maîtrise des techniques de laboratoire couvrant la biologie moléculaire à la manipulation des animaux et de l'immunologie. Présentés ici sont des protocoles pour 1) la génération et la sélection de souches de levure auxotrophes qui peut être facilement sélectionné négativement sans antibiotiques, 2) protocoles alternatifs pour transformer la levure et permettre l'expression de la protéine hétérologue, 3) des démonstrations de techniques de manipulation des animaux appropriés et gavage oral pendant livraison intragastrique de levure recombinante, et 4) des protocoles pour le patch de la dissection de Peyer et le dépistage de la levure recombinant viable et protéine hétérologue fonctionnel. La combinaison de ces protocoles de permettre la production et l'essai d'une souche de levure probiotique capable de délivrer la protéine thérapeutique hétérologue dans le tractus gastro-intestinal.

Protocol

1. mutagenèse UV pour générer auxotrophes souches de levure Générer des courbes de survie pour déterminer les doses nécessaires de l'irradiation UV Préparer YPD (extrait de levure peptone dextrose) les médias et d'autres réactifs énumérés dans le tableau 1 selon les procédures standard 26 et ensemencer des colonies isolées dans 5-10 ml de YPD médias. Incuber les cultures sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N à la saturation pendant au moins 8 heur…

Representative Results

Génération d'une courbe de survie après irradiation UV nécessite placage des cellules de levure dilués de telle sorte que les unités formant colonie (UFC) distinctes sont capables de former. Chaque échantillon de 500 ul recueillies comme décrit ci-dessus contient environ 5 x 10 6 cellules; Toutefois, plus de 100 colonies par plaque sont difficiles à distinguer avec précision. Placage échantillon non dilué ainsi que série des dilutions 1:10 de cellules irradié…

Discussion

Ensemble, les protocoles ici décrivent les étapes essentielles nécessaires pour le développement et les tests de souches de levures probiotiques auxotrophes pour la livraison de la protéine thérapeutique hétérologue à l'intestin. Cette manipulation et l'expérimentation de levure probiotique recombinant nécessite des techniques et des ressources avec lesquelles tout laboratoire individu peut ne pas être actuellement familier. Ainsi, bien que de nombreuses études précédentes ont décrit les protocol…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053