Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей

Summary

Представленные здесь единое описание методов, которые могут быть использованы для разработки, преобразования, администрировать и проверить гетерологичный экспрессию белка пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Пробиотические микроорганизмы интригующая потенциальным средством эффективно и экономично доставлять гетерологичных белков в желудочно-кишечном тракте. Эти организмы способны выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт еще не колонизировать это ^один, что позволяет контролируемой дозировки и ограничение воздействия на препарат выражены. Кроме того, способность легко проектировать эти организмы производить гетерологичный белок в больших масштабах оказывает им экономичной альтернативой синтетических частиц доставки. Однако разработка такого подхода, как недавно продемонстрировано с использованием ауксотрофным пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди ^2, требует знания лабораторных методов, которые традиционно не объединенных в пределах данного исследования, начиная от дрожжей и молекулярной биологии, к способам обработки животных и иммунологическими методами. Таким образом, хотя отдельные процедуры, описанные здесь, сами по себе не новаялабораторные протоколы, цель этой рукописи является представление единой введение в методы, необходимые для экспериментальной проверки пробиотических дрожжей в качестве средств доставки лекарств к мышиной желудочно-кишечного тракта. При условии, представляет собой подборку основных протоколов: 1) поколения ауксотрофных мутантных штаммов дрожжей, которые могут быть легко генетически измененных; 2) превращение дрожжевых культур, чтобы выразить гетерологичный белок; 3) введение рекомбинантного дрожжей в кишечник через желудочный зонд; и 4) восстановление жизнеспособных пробиотических рекомбинантного дрожжей из мышиного кишечника и оценки их экспрессии гетерологичных белков.

Во-первых, хотя многочисленные положительные и отрицательные методы отбора существуют для манипулирования видов дрожжей, негативный отбор, например, посредством использования ауксотрофных маркеров увеличивает как эффективность и легкость, с которой дрожжи могут быть преобразованы и выбран. Положительный отбор трансформантов с использованием антибиотиков, в сотрудничествеntrast, значительно увеличивает стоимость манипуляции дрожжей. Кроме того, выбор дрожжей на содержащую антибиотик твердых средах может позволить усиленному росту нетрансформированных фоновых колоний относительно отбора ауксотрофной дрожжей на синтетической отсева твердых средах (неопубликованные данные). Ауксотрофная дрожжи штаммы, которые испытывают недостаток ферментов критические для синтеза заменимых аминокислот или урацил. Такое дрожжи могут расти только тогда, когда дополняется пропавшего метаболита или метаболического гена, что позволяет негативный отбор, когда дрожжи высевали на синтетической отсева СМИ, что не хватает существенную метаболита. Многие широко используемые Saccharomyces CEREVISIAE лабораторные штаммы, на самом деле уже ауксотрофные мутанты ^3. Промышленное, клиническая и пробиотические штаммы дрожжей, однако, как правило, прототрофным способностью синтезировать все необходимые питательные вещества. Чтобы обеспечить более эффективное генетических манипуляций такого дрожжей, ауксотрофные гены могут быть избирательно нацеленыгенерировать штаммов, которые могут быть выбраны без антибиотиков. Специфическое нацеливание ауксотрофных маркерных генов может быть достигнуто путем ПЦР-опосредованный разрушения гена, опираясь на гомологичной рекомбинации или совсем недавно через CRISPR / cas9 таргетинга ^{4 – 6.} В качестве альтернативы, УФ мутагенеза может быстро генерировать ауксотрофные мутанты даже в дрожжевых штаммов, для которых преобразование с несколькими плазмид технически сложно ^7. В то время как ПЦР таргетинг и CRISPR / cas9 были подробно описаны в другом месте, представлены в первой части этой рукописи является Подробный протокол описания мутагенеза подход УФ создать ауксотрофные штаммы, которые позволят негативной селекции, а не позитивной селекции антибиотиками дрожжевых трансформантов.

Следующий необходимый шаг в использовании таких ауксотрофных штаммов для пероральной доставки гетерологичного белка является превращение дрожжи с плазмидной ДНК. С первого успешного преобразования поименныйт сферопласты сообщенные для Saccharomyces CEREVISIAE в 1978 ^8, многочисленные модификации были охарактеризованы с целью повышения эффективности и легкости, с которой виды дрожжей могут быть генетически модифицированы. Использование электропорации для успешной трансформации ДНК в S. CEREVISIAE был впервые описан в 1985 году ⁹ и с тех пор улучшилась с помощью добавления 1 M сорбита инкубации к осмотически клеток поддержки ^10. Эффективность Электропорация Кроме того, было показано, что зависит от вида дрожжей и штамм, количество клеток и фазы роста, объем электропорация, напряженности поля, а также конкретные буферы ^11. Литий ацетата (LiOAc) преобразование, впервые описан Ito и др. ^12, является одним из наиболее часто используемых протоколов трансформации, так как не требует специального оборудования. Дополнительные анализы показали, что эффективность дрожжевого трансформации LiOAc значительно возрастает, когда клетки собирают в середине логарифмической фазыроста и тепловому шоку в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) и ДНК при 42 ° С ^12. Инкубация всей неповрежденной дрожжей с ПЭГ имеет важное значение для эффективной трансформации, возможно, за счет повышения прикрепление ДНК к клеточной мембране, а также с помощью других эффектов на мембране ^13. Сама литий также повышает проницаемость интактных клетках ^14. Хотя большинство лабораторных S. Штаммы CEREVISIAE может быть легко преобразована с помощью преобразования LiOAc ^3, другие виды дрожжей могут быть более эффективно трансформированы с использованием альтернативных протоколов. Pichia pastoris, например, наиболее эффективно преобразуется с помощью электропорации, а не трансформации LiOAc ^13. Это имеет решающее значение, поэтому, чтобы испытать множественный методы преобразования и оптимизации инкубации и концентрации реагентов при попытке генетически модифицировать неохарактеризованных штамм дрожжей. Таким образом, эта рукопись описывает как LiOAc трansformation и электропорации также методы трансформации ауксотрофной мутанта и дикого типа S. boulardii. Заинтересованные читатели направлены на недавних обзоров для тщательной описаний эволюции трансформации дрожжей, альтернативных протоколов, и дальнейших обсуждений возможных механизмов действия ^13,15. Трансформация дрожжей с плазмиду, кодирующую легко обнаружить белок является, кроме того, важное значение для нисходящего тестирования в целях обеспечения надлежащего выражения и функцию чужеродного протеина. Myriad различные белки могут быть выбраны в зависимости от конечной цели терапевтического исследования и антителами, доступных для обнаружения белка с помощью иммуноблоттинга, ELISA, и другими методами. Протоколы для этих методов были тщательно описаны в другом месте ^16,17, и может быть использовано для определения уровней гетерологичной продукции белка из трансформированных дрожжей по сравнению со стандартными кривыми. Для целей демонстрации и показатьуспешное производство очень широко используется белка в дрожжевой биологии, эта рукопись представляет преобразование с плазмидой, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), который позволяет для последующего обнаружения с помощью флуоресцентной микроскопии.

Не менее важно, чтобы производство пробиотических микроорганизмов, которые экспрессируют гетерологичный белок является надлежащее управление и обнаружение этих микроорганизмов, обитающих внутри желудочно-кишечного тракта тканей, как описано в части трех и четырех. Администрация рекомбинантного дрожжей через желудочный зонд позволяет для доставки контролируемых количеств дрожжей непосредственно в желудок, из которого мыши C57BL / 6, естественно неспособным рвота ^18. Тем не менее, неправильное обращение животных и через желудочный зонд может привести к повреждению пищевода и перфорации, перфорация желудка, введения трахеи и аспирационной пневмонии ^19,20. Плохая техника и неопытность может, кроме того, повысить изменчивость в мышиных иммунных реакций и экспериментальной RESULTS, которые были отнесены к животным стресса на желудочный зонд ^21,22. Практика в правильной технике может, таким образом, не только ослабить животное дискомфорт, но может также увеличить точность экспериментальных результатов. Эта рукопись описывает и демонстрирует обработку животных и желудочный зонд для введения контролируемых дозах рекомбинантного дрожжей.

Наконец, важно, чтобы подтвердить успешную доставку рекомбинантного дрожжей путем анализа лимфоидных тканей на присутствие дрожжей и гетерологичного белка. Желудочно-кишечного иммунные ткани, которые могут наиболее легко и предсказуемо быть рассмотрены на присутствие дрожжей пейеровы бляшки. Пейеровы бляшки являются вторичными лимфоидных органах вдоль тонкой кишки, которые являются ключевыми сайты слизистой индукции иммунного ответа ^23. Антигены из просвета переносятся transcellularly через микроскладкой (M) клеток в эпителии и высвобождаются в пейеровы бляшки, тем самым подвергая вложитьd антиген представляющих клеток кишечного просвета содержимое. Хотя поглощение частиц через кишечный эпителий также может быть достигнуто путем бокаловидных клеток, эти клетки, как было показано только занимают частиц менее 0,02 мкм в диаметре ^24. Трансэпителиальная дендриты продлен с CD103 ⁺ дендритные клетки (ДК) также занимают небольшие частицы из просвета кишечника ^25; Однако, не существует в настоящее время никаких сообщений, демонстрирующих, что CD103 ⁺ ДК занимают частицы более бактерий. Таким образом, нетронутыми пробиотик дрожжи, среднего размера между 3-6 мкм в диаметре, скорее всего, будет рассмотрен М-клеток и переносили в пейеровы бляшки. Описанный здесь является протоколом для сбора и скрининга пейеровы бляшки для жизнеспособного рекомбинантного дрожжей, хотя эта процедура также может быть легко адаптированы для оценки поглощение пробиотических бактерий.

Таким образом, оценивая рекомбинантный пробиотик дрожжи для доставки изrapeutic белки в кишечнике требует знания в лабораторных методик, охватывающих молекулярной биологии к обработке животных и иммунологии. Представленные здесь протоколы для 1) генерация и отбор ауксотрофных штаммов дрожжей, которые могут быть легко отрицательно выбран без антибиотиков, 2) альтернативные протоколы для преобразования дрожжи и позволяют экспрессию гетерологичного белка, 3) демонстрации надлежащих методов обработки животных и желудочный зонд для внутрижелудочной доставки рекомбинантного дрожжей и 4) протоколы для коммутационной диссекции Пейера и скрининга жизнеспособного рекомбинантного дрожжей и функциональной гетерологичного белка. В совокупности эти протоколы позволят для генерации и проверки пробиотика штамма дрожжей, способных доставлять гетерологичный терапевтический белок в желудочно-кишечном тракте.

Protocol

1. УФ мутагенеза для генерации Ауксотрофные штаммов дрожжей Создать кривые выживаемости определение необходимой дозы УФ-облучения Подготовьте YPD (дрожжевой экстракт пептон декстроза) носитель и другие реагенты, перечисленные в таблице 1, в соответствии со стандарт?…

Representative Results

Генерация кривой выживаемости следующей УФ-облучения требует металлизацию разбавленных дрожжевых клеток таким образом, что различные колониеобразующих единиц (КОЕ) способны образовывать. Каждый образец 500 мкл собирали, как описано выше, содержит около 5 х 10 6 кл…

Discussion

Вместе протоколы в данном документе описываются основные шаги, необходимые для разработки и тестирования ауксотрофных пробиотических штаммов дрожжей для доставки гетерологичной терапевтического белка в кишечнике. Эта манипуляция и тестирование рекомбинантного пробиотика дрожжей …

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053