Transformasjon av Probiotiske gjær og deres utvinning fra Gastrointestinale immun Vev Etter oralt inntak i Mus

Summary

Presenteres her er en enhetlig beskrivelse av teknikker som kan brukes til å utvikle, omforme, administrere og teste heterologe protein uttrykk av de probiotiske gjær Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Probiotiske mikroorganismer er en spennende potensielle hjelp av effektiv og økonomisk levere heterologe proteiner i fordøyelseskanalen. Disse organismene er i stand til å overleve passasje gjennom mage-tarmkanalen, men ikke kolonisere det ^1, slik at kontrollert dosering og begrense eksponering for medikamentet uttrykt. Videre er muligheten til enkelt å konstruere disse organismene for å fremstille heterologe proteiner i stor skala gjør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leverings partikler. Imidlertid utvikling av en slik tilnærming, som nylig demonstrert ved anvendelse av en auxotrof stamme av de probiotiske gjæren Saccharomyces boulardii ^2, krever kunnskap om laboratorieteknikker som ikke tradisjonelt kombinert innenfor et gitt studie, som strekker seg fra gjær og molekylær biologi til dyr behandlingsteknikker og immunologiske metoder. Således, selv om de enkelte fremgangsmåtene beskrevet heri er ikke i seg selv nyelaboratorieprotokoller, er målet med dette manuskriptet er å presentere en helhetlig innføring i teknikker som trengs for eksperimentell testing av probiotiske gjær som narkotika levering kjøretøy til murine mage-tarmkanalen. Forutsatt er en samling av viktige protokoller for: 1) generasjon av auxotrofe mutant stammer av gjær som kan lett bli genetisk manipulerte; 2) transformasjon av gjærkulturer å uttrykke heterologe protein; 3) administrasjon av rekombinant gjær til tarmen via oral inntak; og 4) utvinning av levedyktige probiotiske rekombinant gjær fra den murine tarmen og vurdering av deres heterolog proteinekspresjon.

Første, selv om en rekke positive og negative seleksjonsfremgangsmåter eksisterer for manipuleringen av gjærarter, negativ seleksjon, for eksempel ved bruk av auksotrofe markører øker både effektivitet og letthet som gjær kan bli transformert og selektert. Positiv utvelgelse av trans bruker antibiotika, i samarbeidntrast, øker betydelig kostnaden for gjær manipulasjon. Videre kan utvalget av gjær på antibiotikaholdig faste medier gir mulighet for økt vekst av ikke-transformerte bakgrunns kolonier i forhold til valg av auxotrofe gjær på syntetisk slippe ut faste medier (upubliserte observasjoner). Auksotrof gjærstammer er som mangler enzymer kritiske for syntese av essensielle aminosyrer eller uracil. Slike gjær kan vokse bare hvis supplert med manglende metabolitt eller metabolsk genet, og dermed gjør negativ seleksjon når gjær er platet på syntetisk slippe ut media som mangler essensielle metabolitten. Mange brukte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er nemlig allerede auxotrofe mutanter ^3. Industrial, klinisk, og probiotiske gjærstammer, men er vanligvis prototrofe med evnen til å syntetisere alle nødvendige næringsstoffer. For å muliggjøre mer effektiv genetisk manipulering av slike gjær, kan auxotrofe gener selektivt målrettetå generere stammer som kan velges uten antibiotika. Spesifikk målretting av auxotrofe markørgener kan oppnås gjennom PCR-mediert genet avbrudd avhengig av homolog rekombinasjon eller senere gjennom CRISPR / Cas9 målgruppe ^4-6. Alternativt kan UV-mutagenese for raskt å generere auxotrofe mutanter som til og med i gjærstammer hvor transformasjon med flere plasmider som er teknisk vanskelig ^7. Mens PCR målretting og CRISPR / Cas9 er nøye beskrevet andre steder, presentert i del en av dette manuskriptet er en detaljert protokoll som beskriver en UV mutagenese tilnærming for å skape auxotrofe stammer som vil tillate for negativ seleksjon snarere enn positiv antibiotika utvalg av Gjærtransformanter.

Det neste nødvendige trinn i bruken av slike stammer auxotrofe for oral levering av heterologt protein er gjær transformasjon med plasmid DNA. Siden den første vellykkede transformasjonen av yeast sfæroplaster rapportert for Saccharomyces cerevisiae i 1978 ^8, har en rekke modifikasjoner blitt karakterisert for å øke effektiviteten og letthet som gjærarter kan bli genetisk modifisert. Bruken av elektroporering for vellykket transformasjon av DNA til S. cerevisiae ble først beskrevet i 1985 ⁹ og har siden blitt forbedret ved tilsetning av 1 M sorbitol inkubasjon for å osmotisk støttelegemer ^10. Electroporation effektivitet har dessuten vist seg å avhenge av gjær arter og belastning, cellenummer og vekstfase, elektroporering volum, feltstyrke, og bestemte buffere ^11. Litiumacetat (LiOAc) transformasjon, opprinnelig beskrevet av Ito et al. ^12, er blant de mest vanlig anvendte transformasjonsprotokoller som det krever ikke spesielt utstyr. Ytterligere analyser viste at effektiviteten av LiOAc gjærtransformasjons øker sterkt når celler er samlet i midt-log fasenav vekst og varmesjokkbehandlet i nærvær av polyetylenglykol (PEG) og DNA ved 42 ° C ^12. Inkubasjon av hele intakte gjær med PEG er en forutsetning for effektiv omforming, eventuelt gjennom å forbedre binding av DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen ^13. Litium seg også øker permeabiliteten av intakte celler ^14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan lett bli transformert ved anvendelse av LiOAc transformasjon ^3, kan andre gjærarter bli mer effektivt transformert ved hjelp av alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt omdannes via elektroporering i stedet for LiOAc transformasjon ^13. Det er avgjørende, og derfor, for å teste multiple metoder for transformasjon og for å optimalisere inkubasjonsperioder og reagenskonsentrasjoner når du forsøker å genetisk modifisere en uncharacterized gjærstamme. Dette manuskriptet beskriver således både LiOAc transformation og elektroporasjon som teknikker for transformasjon av auxotrofe mutant og vill type S. boulardii. Interesserte lesere henvises til siste anmeldelser for grundige beskrivelser av utviklingen av gjær transformasjon, alternative protokoller, og videre diskusjoner om mulige virkningsmekanismer ^13,15. Transformasjon av gjær med plasmid som koder for en lett påvisbar protein er dessuten essensiell for nedstrøms testing for å sikre riktig ekspresjon og funksjon av heterologt protein. Myriad forskjellige proteiner kan velges avhengig av endelige formålet med den terapeutiske studier og antistoffer som er tilgjengelige for protein deteksjon av immunblotting, ELISA, og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blitt grundig beskrevet andre steder ^16,17, og kan brukes til å bestemme nivåer av heterolog proteinproduksjon fra transformert gjær ved sammenligning med standardkurver. I forbindelse med demonstrasjon og å visevellykket produksjon av en meget vanlig brukt protein i gjær biologi, presenterer dette manuskriptet transformasjon med plasmid som koder for grønt fluorescerende protein (GFP), noe som gir mulighet for etterfølgende påvisning ved hjelp av fluorescens mikroskopi.

Like viktig for fremstilling av probiotiske organismer som uttrykker heterologe proteinet er korrekt administrasjon og deteksjon av disse mikroorganismer i mage-tarm vev, som beskrevet i deler av tre og fire. Administrering av rekombinant gjær via oral tvangsforing gjør det mulig for avgivelse av kontrollerte mengder av gjær direkte inn i magesekken, som C57BL / 6 mus er naturligvis i stand til oppkast ^18. Imidlertid kan feil dyr håndtering og føring føre til esophageal skader og perforering, mage perforering, tracheal administrasjon, og aspirasjonspneumoni ^19,20. Dårlig teknikk og uerfarenhet kan dessuten øke variasjonen i murine immunresponser og eksperimentell resuLTS, som har blitt tilskrevet dyret stresset på oralt inntak ^21,22. Praksis i riktig teknikk kan således ikke bare svekke dyret ubehag, men kan også øke presisjonen av eksperimentelle resultater. Dette manuskriptet beskriver og demonstrerer dyr håndtering og oral sonde for administrasjonen av kontrollerte doser av rekombinant gjær.

Endelig er det viktig å bekrefte vellykket levering av rekombinant gjær ved å analysere lymfevev for tilstedeværelsen av gjær og heterologt protein. Gastrointestinale immun vev som kan lettest og forutsigbart undersøkes for tilstedeværelse av gjær er Peyers lapper. Peyers patcher er sekundære lymfoide organer langs tynntarmen som er sentrale områder av mucosal immunrespons induksjon ^23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gjennom microfold (M) celler i epitelet og slippes ut i Peyers patcher, og dermed utsette vedlegged antigenpresenterende celler til intestinal luminale innhold. Selv om partikkelopptaket over tarmepitelet kan også oppnås ved slimceller, har disse cellene er vist å bare ta opp partikler mindre enn 0,02 pm i diameter ^24. Transepitelial dendritter forlenget fra CD103 ⁺ dendritiske celler (DC) også ta opp små partikler fra den intestinale lumen ^25; men det er foreløpig ingen rapporter som viser at CD103 ⁺ DC ta opp partikler større enn bakterier. Således intakt probiotisk gjær, med en gjennomsnittlig størrelse mellom 3-6 mikrometer i diameter, er mest sannsynlig å bli tatt opp av M-celler og overført til Peyers lapper. Beskrevet her er en protokoll for innsamling og screening av Peyers patcher for levedyktig rekombinant gjær, selv om denne prosedyren kan også enkelt tilpasses for å vurdere opptak av probiotiske bakterier.

I sammendraget, vurdere rekombinant probiotiske gjær for levering avrapeutic proteiner til tarmen krever ferdigheter i laboratorieteknikker som spenner molekylærbiologi til dyr håndtering og immunologi. Presenteres her er protokoller for en) generering og screening av auxotrofe gjærstammer som lett kan negativt valgt uten antibiotika, 2) alternative protokoller for å forvandle gjær og aktivere uttrykk for heterologe protein, 3) demonstrasjoner av riktig dyr håndtering teknikker og oralt inntak for intragastrisk levering av rekombinant gjær, og 4) protokoller for Peyer patch disseksjon og screening for levedyktige rekombinante gjær og funksjonelt heterologt protein. Til sammen vil disse protokollene tillate generering og testing av en probiotisk gjærstamme i stand til å levere heterologe terapeutiske protein til mage-tarmkanalen.

Protocol

1. UV Mutagenese å generere Auxotrofe gjærstammer Generere overlevelseskurver for å bestemme nødvendige doser av UV-bestråling Forbered YPD (gjærekstrakt pepton dekstrose) media og andre reagenser som er oppført i tabell 1, i henhold til standardprosedyrer, 26 og inokuler enkeltkolonier inn i 5-10 ml YPD medium. Inkuber kulturer på en berg-trommel ved 30 ° CO / N til metning i minst 8 timer. Bestem cellekonsentrasjon på O / N kulturer ved hjelp av et sp…

Representative Results

Generering av en overlevelseskurve etter UV-bestråling krever plettering av fortynnede gjærceller, slik som forskjellige kolonidannende enheter (CFU) er i stand til å danne. Hver 500 pl prøve oppsamlet som beskrevet ovenfor, inneholder ca. 5 x 10 6 celler; imidlertid, er større enn 100 kolonier per plate er vanskelig å nøyaktig skille. Plating ufortynnet prøve samt serielle 1:10 fortynninger av bestrålte celler dermed sørger for at CFU kan være nummerert ved hver UV…

Discussion

Sammen protokollene her beskrive de grunnleggende trinnene som er nødvendige for utvikling og testing av auxotrofe probiotiske gjærstammer for levering av heterologe terapeutiske protein til tarmen. Dette manipulasjon og testing av rekombinant probiotiske gjær krever teknikker og ressurser som ethvert individ laboratorium ikke kan nå være kjent. Derfor, selv om mange tidligere studier har beskrevet ovenfor protokoller for flere gjær og musestammer, disse metodene har ikke til forfatternes kunnskap blitt presentert…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053