줄기 세포처럼<em> Xenopus의</em> 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em> 체외</em> 및<em> 생체</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
척추 동물의 신경계 세포의 neuroepithelial 균질 층으로서 신경 판으로부터 나온다. 개발 프로그램은 신경 판의 지역화 동안, 유도 인코딩 설립하는 방법을 이해하는 것은, 현재, 발달 생물학의 주요 목표입니다. 다른 시스템에 비해, 실험적 의무 Xenopus의 배아는 신경 발달의 초기 단계 1,2- 분석을위한 선택의 모델이다. 이 배아의 큰 숫자를 얻기 쉽고, 외부 개발 neurulation 3의 첫 번째 단계에 액세스 할 수 있습니다. 많은 도구를 실험적으로 Xenopus의 laevis의 (X를 laevis의) 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 마이크로 주입 함께 약리 도구를 유도 수법의 포함의 mRNA 또는 morpholinos (MO),의는, 함수의 이득 (GOF)과 기능 (LOF)의 손실과 경로 4,5 신호의 특정 변경을 제어 허용한다. 즐stocoel 지붕 외배엽은 포배, 또는 초기 낭배 배아 동물 기둥 주위에 위치하며 "동물 캡 '(AC)라고도 유전자 발현 이전에의 조작에 의해 프로그램 될 수있는 다 능성 세포의 공급원은 준비 외식. 이 원고 X.를 사용하는 상세한 프로토콜은 laevis의 교류 외식은 시험관 및 생체 분자 메커니즘 및 세포 프로세스 기본 신경 개발에서 테스트합니다.
기술은 제노 올챙이 신경 튜브에서의 유전자 발현 패턴의 미세 관찰 운명 결정 큐의 식별에 예비 단계를 허용되게된다. 평면 장착 조직 관찰은 통상적으로 병아리 배아 (6)의 연구에서 사용되는 반면, 그것은 적절 제노 푸스에서 설명되지 않았다. 2 또는 4 세포 단계의 배아의 할구로 합성의 mRNA 또는 MO 주입에 의한 유전자 발현의 조작은 AC의 프로그래밍을 할 수 있습니다(4) 외식. 안티 BMP 요인 머리의 발현에 의해 뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 경로의 예를 억제를 들어, AC 세포 3에 신경 정체성을 제공합니다. 프로토콜은 음이온 교환 수지 입자와 직접 접촉을 통해 외인성 단서 AC 이식편의 로컬 시간 및 노출 제어를 수행하기위한 상세한된다. 마지막 기술은 분해 및 재 관련 프로그램 별개의 세포로부터 제조 된 혼합 외식의 이식에 의해 생체 내에서 신경 전구 세포의 발달 기능을 테스트하기위한 기술되어있다.
개구리 배아 초기 척추 동물의 신경 발달을 연구하는 강력한 모델이다. 유전자 발현의 조작을 결합하여 체외 배양을 절편하기 neuroepithelium의 지역화, 확산 및 형태 형성 7-12의 연구에 중요한 정보를 제공합니다. AC 외식의 프로그래밍은 생체 13,14 기능 중심의 개발을 허용. 사용이식 절편의 15는 신경 능선 차별화 프로그램 (16)을 유도하는 최소한의 전사 스위치의 식별되었다. 조나의 limitans의 intrathalamica (ZLI)는 꼬리 전뇌의 성장과 지역화를 제어하는 소닉 고슴도치 (쉬)를 분비 신호 센터입니다. 연속적 쉬에 노출 될 때, 세 가지 전사 인자 유전자 coexpressing neuroepithelial 세포 – barH 형 호 메오 -2- (barhl2)는 orthodenticle -2- (의 Otx2)과 이로쿼이 -3- (irx3는) – ZLI 구획의 두 가지 특성을 획득 님 역량 쉿 표현, 그리고 앞쪽에 신경 판 세포로부터 분리 할 수있는 능력. 모델 시스템으로, neuroepithelial 세포에 ZLI 운명의 유도는 8 표시됩니다.
이러한 프로토콜은 기본 MEC를 탐험 발달 생물 학자와 다른 연구자에 대한 간단하고 저렴하고 효율적인 도구를 제공을 목표로키 신경 세포 행동의 hanisms. 이러한 프로토콜은 매우 다재다능하고 외부와 고유 신경 결정 큐의 큰 범위의 조사를 할 수 있습니다. 그것은 신경 계통 약속, 유도 상호 작용과 세포 행동의 생체 분석에서 장기를 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 개발은 (3,31,32 검토) 주변 조직에서 세포 발달 프로그램과 신호 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 여기서 우리는 X.에 사용될 수있는 프로토콜의 집합을 기술 외부 및 신경 운명 결정과 시험관 및 생체 내에서 신경 형태 형성에 관여하는 본질적인 요소를 탐구하는 배아를 laevis의. 이러한 프로토콜은 X.에 그대로 사용 할 수있다 tropicalis 배…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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