In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
कशेरुकी तंत्रिका तंत्र neuroepithelial कोशिकाओं का एक सजातीय परत के रूप में तंत्रिका प्लेट से उभर रहे हैं। विकास कार्यक्रमों के तंत्रिका प्लेट की regionalization के दौरान, प्रेरित इनकोडिंग, और स्थापित कर रहे हैं कि कैसे को समझना, वर्तमान में, विकास जीव विज्ञान में एक प्रमुख लक्ष्य है। अन्य प्रणालियों की तुलना में, प्रयोगात्मक उत्तरदायी Xenopus भ्रूण तंत्रिका विकास 1,2 के प्रारंभिक चरणों का विश्लेषण करने के लिए पसंद का एक मॉडल है। यह भ्रूण की बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए आसान है, और बाह्य विकास neurulation 3 के बहुत पहले कदम के लिए पहुँच देता है। कई उपकरण प्रयोगात्मक Xenopus laevis (एक्स laevis) भ्रूण के विकास में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं। सूक्ष्म इंजेक्शन एक साथ जैव रासायनिक और औषधीय उपकरणों के साथ inducible राज्यमंत्री सहित mRNAs या morpholinos (एमओ), की, समारोह के लाभ (GOF) और समारोह (LOF) की हानि और रास्ते 4,5 संकेत के विशिष्ट परिवर्तन नियंत्रित की अनुमति देता है। blastocoel छत बाहरी झिल्ली, एक ब्लासटुला, या एक बहुत जल्दी गेसट्रुला भ्रूण के पशु ध्रुव के आसपास स्थित है, और 'पशु कैप' (एसी) के रूप में भेजा, जीन अभिव्यक्ति से पहले के हेरफेर से प्रोग्राम किया जा सकता है कि pluripotent कोशिकाओं का एक स्रोत है तैयारी explants। इस पांडुलिपि में एक्स का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल रहे हैं laevis एसी explants इन विट्रो और इन विवो आणविक तंत्र और सेलुलर प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्रिका विकास में परीक्षण करने के लिए।
एक तकनीक एक Xenopus मेढक न्यूरल ट्यूब में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के ठीक अवलोकन, भाग्य दृढ़ संकल्प संकेतों की पहचान करने में एक प्रारंभिक चरण के लिए अनुमति देता है, प्रस्तुत किया है। फ्लैट पर चढ़कर ऊतकों का अवलोकन सामान्यतः लड़की भ्रूण 6 के अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है, जबकि यह ठीक से Xenopus में वर्णित नहीं किया गया है। 2 या 4 सेल चरण भ्रूण की blastomeres में सिंथेटिक mRNA या एमओ इंजेक्शन द्वारा जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर एसी की प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है4 explants। विरोधी बीएमपी कारक नोगिन की अभिव्यक्ति से अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) मार्ग का उदाहरण निषेध के लिए, एसी 3 कोशिकाओं को एक तंत्रिका पहचान देता है। प्रोटोकॉल एक आयनों विनिमय राल मनका के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से बाह्य संकेतों के लिए एसी explants की स्थानीय और समय-नियंत्रित जोखिम के प्रदर्शन के लिए विस्तृत है। अंत में एक तकनीक अलग है और फिर से संबद्ध प्रोग्राम किया अलग कोशिकाओं से तैयार मिश्रित explants के प्रत्यारोपण द्वारा विवो में तंत्रिका पूर्वज की विकास संबंधी सुविधाओं के परीक्षण के लिए वर्णित है।
मेंढक भ्रूण जल्दी कशेरुकी तंत्रिका विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के संयोजन में इन विट्रो संस्कृतियों explant को neuroepithelium regionalization, प्रसार, और morphogenesis 7-12 के अध्ययन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। एसी explants की प्रोग्रामिंग पूर्व vivo 13,14 एक कार्यात्मक दिल के विकास की अनुमति दी। उपयोगग्राफ्टिंग explant के 15 तंत्रिका शिखा भेदभाव कार्यक्रम 16 उत्प्रेरण न्यूनतम ट्रांसक्रिप्शनल स्विच की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया। Zona limitans intrathalamica (zli) दुम अग्रमस्तिष्क के विकास और regionalization नियंत्रित करने के लिए ध्वनि का हाथी (श्श्श) स्रावित करता है कि एक संकेतन केंद्र है। लगातार श्श्श के संपर्क में, तीन प्रतिलेखन कारक जीन coexpressing neuroepithelial कोशिकाओं – बाढ़ की तरह homeobox -2 (barhl2), orthodenticle -2 (otx2) और Iroquois -3 (irx3) – zli डिब्बे के दो विशेषताओं के अधिग्रहण: करने के लिए क्षमता श्श्श व्यक्त, और पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट कोशिकाओं से अलग करने की क्षमता। एक मॉडल प्रणाली के रूप में, neuroepithelial कोशिकाओं में एक zli भाग्य की प्रेरण 8 प्रस्तुत किया जाएगा।
इन प्रोटोकॉल मौलिक एमईसी पता लगाने के लिए विकासात्मक जीव और अन्य शोधकर्ताओं के लिए सरल, सस्ता, और कुशल उपकरण उपलब्ध कराने का उद्देश्यकुंजी तंत्रिका कोशिका व्यवहार के hanisms। इन प्रोटोकॉल बहुत बहुमुखी हैं और बाह्य और आंतरिक तंत्रिका दृढ़ संकल्प संकेतों की एक बड़ी रेंज की जांच की अनुमति। यह तंत्रिका वंश प्रतिबद्धता, प्रेरक बातचीत और सेल व्यवहार के vivo विश्लेषण में लंबी अवधि के लिए परमिट।
तंत्रिका विकास (3,31,32 में समीक्षा) आसपास के ऊतकों से सेलुलर विकास कार्यक्रमों और संकेतों के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा करवाया जाता है। यहाँ हम एक्स में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटोकॉल…
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |