Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
A grande maioria de espectrometria de massa (MS) baseados em métodos de análise de proteínas envolvem um passo de digestão enzimática antes da detecção, tipicamente com tripsina. Este passo é necessário para a geração de péptidos de baixo peso molecular, geralmente com PM <3000-4000 Da, que caem dentro do intervalo de varrimento efectivo de instrumentação de espectrometria de massa. protocolos convencionais envolvem O / N digestão enzimática a 37 ºC. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de uma variedade de estratégias, que envolvem normalmente a utilização de um micro-reactor com enzimas imobilizadas ou de uma variedade de processos físicos complementares que reduzem o tempo necessário para a digestão proteolítica de alguns minutos (por exemplo, microondas ou alta pressão). Neste trabalho, nós descrevemos um método simples e de baixo custo que pode ser implementado em qualquer laboratório para a realização rápida digestão enzimática de uma proteína. O (ou mistura de proteína) proteína é adsorvida em alta perf de fase inversa C18-ligadoormance partículas de sílica com cromatograf ia líquida (HPLC), pré-carregados numa coluna capilar, e com tripsina em tampão aquoso é administrada por perfusão durante as partículas para um curto período de tempo. Para permitir a detecção em linha de MS, os peptídeos trípticos são eluídas com um sistema de solvente com o aumento do teor orgânico directamente na fonte de iões de MS. Esta abordagem evita a utilização de partículas de alto preço enzima imobilizada e não necessitam de qualquer ajuda para completar o processo. a digestão de proteínas e a análise da amostra completa pode ser realizada em menos de 3 minutos ~ e ~ 30 min, respectivamente.
Introduction
A identificação e caracterização das proteínas purificadas é frequentemente conseguido através de técnicas de MS. A proteína é digerido com uma enzima e os seus péptidos são ainda analisados por MS utilizando uma configuração experimental simples de infusão. A digestão proteolítica é necessário para a geração de fragmentos peptídicos pequenos que caem na gama de massa da maioria dos analisadores útil MS, e que pode ser facilmente fragmentado por baixo de energia de colisão de dissociação induzida para gerar informação sobre a sequência de aminoácidos. Para as proteínas isoladas ou misturas de proteínas simples, não há mais necessidade de separação cromatográfica dos péptidos antes da detecção MS. Uma mistura de péptidos 25-50 podem ser facilmente analisadas por infusão da amostra com uma bomba de seringa directamente na fonte de iões de MS.
O espectrómetro de massa pode realizar a análise e confirmar a sequência de uma proteína dentro de um curto espaço de tempo. Com os métodos modernos de aquisição de dados, este processo pode ser realizado Within alguns minutos ou mesmo segundos. O fator limitante para completar todo o processo em uma escala de tempo curta é a etapa de digestão proteolítica. Normalmente, isto é realizado ao longo de algumas horas (ou O / N), em solução, a 37 ºC, utilizando substrato: rácios de enzimas de (50-100): 1. Para reduzir o tempo de digestão enzimática para minutos ou segundos, microrreactores enzima imobilizada, sob a forma de reactores de microfluidos ou cartuchos disponíveis comercialmente, foram descritos. 06/01 Tipicamente, a enzima é imobilizada por ligação covalente, não-covalente / adsorção física, complexo formação ou encapsulamento, 3,6 a eficiência melhorada do processo enzimático a ser activada pela grande superfície para volume e rácios de enzima e substrato. As vantagens adicionais de reactores imobilizadas incluem a redução da autólise e interferência do enzima na análise de MS, melhorou a estabilidade da enzima e reutilização. Uma variedade de abordagens, utilizando vidro ou dispositivos microfabricados poliméricos têm sido descritos,usando enzimas imobilizadas em esferas magnéticas por interações antígeno-anticorpo, 7,8 aprisionados em redes de nanopartículas de ouro, 9 encapsulado em titânia de alumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 ou capturados através de Ni-NTA ou His-Tag formação do complexo. 6 Alternativamente , capilares tubulares abertas com enzimas imobilizadas têm sido desenvolvidos, assim. 12 além disso, a clivagem proteolítica aumentada foi demonstrada utilizando a irradiação de microondas controlado 13 ou assistida por pressão ou ciclagem tecnologia pressão (PCT) para reduzir os tempos de reacção a 30-120 min. 14
Apesar das várias vantagens de reactores de enzimas imobilizadas, os custos de cartuchos comerciais é alta, a disponibilidade de dispositivos de microfluidos para uso de rotina é limitado, e o uso de tecnologias de micro-ondas ou de PCT resultados em necessidade de instrumentação adicional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método que circumvents estas desvantagens, e que pode ser facilmente implementado em cada laboratório para capacitar investigadores com uma abordagem simples e eficaz para a realização de clivagem enzimática das proteínas na preparação para análise por MS em poucos minutos. A abordagem baseia-se na utilização de, C18-partículas hidrofóbicas, que são pré-carregados em um capilar ou dispositivo de microfluidos, e a adsorção da proteína (s) de interesse sobre essas partículas, seguido por digestão enzimática durante a infusão da enzima sobre o de leito fixo e de proteína (s) capturado. Nesta abordagem, o substrato é imobilizada através de interacções não covalentes, e a enzima é infundido através da proteína imobilizada. A eficiência proteolítica digestão é aumentada pelas grandes áreas de superfície de partícula que expõem a proteína para o processamento enzimático, as distâncias e os tempos de difusão de e para a superfície de partículas reduzido, uma melhor transferência de massa, sem ligação covalente que pode afectar a actividade da enzima, a capacidade Avaliado com a rapideze combinações de diferentes enzimas, descartável, e a multiplexação, se o processo é executado num formato de microfluidos. Esta abordagem é demonstrada com o uso de uma mistura de proteínas padrão e tripsina a enzima mais comumente utilizado para a digestão proteolítica antes da detecção ESI-MS. O espectrómetro de massa utilizados para a detecção neste estudo foi um instrumento linear armadilha de quadrupolo (LTQ).
Protocol
Representative Results
Discussion
O microreator descrito neste trabalho fornece um fácil de implementar configuração experimental para a realização de digestão enzimática de proteínas para permitir a análise MS e identificação em menos de 30 min. As vantagens deste sistema, em comparação com métodos convencionais, incluem a simplicidade, a velocidade e baixo consumo de reagentes e baixo custo. Em particular, não há necessidade de caros esferas de tripsina imobilizada e os cartuchos. A preparação do microreator capilar é simples <stron…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Riferimenti
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