Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
kütle spektrometrisi (MS) büyük çoğunluğu, protein analiz yöntemleri, tipik olarak tripsin ile, saptama için enzimatik sindirim aşamasından önce dahil tabanlı. Bu adım, kütle spektrometrisi enstrümantasyon etkili tarama aralığı içinde MW <3.000-4.000 Da genellikle, küçük molekül ağırlıklı peptid üretimi için gereklidir. Geleneksel protokoller 37 ºC'de O / N enzimatik sindirim içerir. Son gelişmeler, tipik olarak, örneğin, mikrodalga ya da yüksek immobilize enzim ya da bir kaç dakika için proteolitik sindirimi için gerekli zamanı azaltmak tamamlayıcı fiziksel işlemler (bir dizi bir mikroreaktör kullanılmasını içeren, farklı stratejiler, gelişmesine yol açmıştır baskı). Bu çalışmada, bir proteinin hızlı bir enzimatik sindirim elde etmek için herhangi bir laboratuvar uygulanabilir basit ve maliyet-etkin bir yaklaşımı açıklar. Protein (veya protein karışımı) C18-bağlanmış ters fazlı yüksek perf üzerine emdirilirbir kılcal sütununda önceden sıvı kromatografisi (HPLC), silis parçacıkları sergilemiş ve sulu tampon içinde tripsin kısa bir süre için parçacıklar üzerinde demlenir. on-line MS algılanmasını sağlamak için triptik peptidler MS iyon kaynağı, doğrudan artan bir organik içeriğe sahip olan bir çözücü sistemi ile elüt edilmiştir. Bu yaklaşım, yüksek fiyatlı immobilize enzim parçacıklarının kullanımını önler ve işlemi tamamlamak için herhangi bir yardım gerektirmez. Protein sindirimi ve tam bir örnek analizleri sırasıyla ~ 30 dakika az 3 ~ daha dk gerçekleştirilebilir ve yapılabilir.
Introduction
saflaştırılmış proteinlerin belirlenmesi ve tanımlanması, genellikle MS teknikleri kullanılarak elde edilir. Protein bir enzimle sindirilir ve peptitler, basit bir infüzyon deney düzeneği kullanılarak MS ile analiz edilir. Proteolitik sindirim çoğu MS analiz yararlı kütle aralığında düşüş küçük peptid fragmanlarını üretmek için gerekli olan ve kolayca amino asit sekansı bilgi üretmek için düşük enerji çarpışma kaynaklı ayrışma yoluyla parçalanmış olabilir. izole edilmiş proteinler veya basit bir protein karışımları için, MS tespiti önce peptitlerin kromatografik ayrılması için başka bir ihtiyaç vardır. 25-50 peptidlerinin bir karışım, kolayca MS iyonu kaynağı, doğrudan bir şırınga pompası ile örnek infüzyonu ile analiz edilebilir.
kütle spektrometresi analizi yapmak ve kısa zaman çerçevesi içinde bir proteinin dizisini teyit edebilir. modern veri elde etme yöntemleri ile, bu işlem, ağ yapılabilirbirkaç dakika, hatta saniye ithin. Kısa bir süre ölçeğinde tüm süreci tamamlamada sınırlayıcı faktör proteolitik sindirim adımdır. Tipik haliyle, bu işlem birkaç saat süreyle gerçekleştirilir (veya O / N), çözelti içinde, 37 ° C 'de, alt-tabaka kullanılarak: (50-100) enzim oranı: 1 arasındadır. Tarif edilmiştir mikroakışkan reaktörler veya ticari olarak temin edilebilen kartuş formunda, dakika ya da saniye hareketsizleştirilmiş enzim mikroreaktörlerde enzimatik sindirim süresini azaltmak için. 1-6 Tipik olarak enzim kovalent, kovalent olmayan bir fiziksel / adsorpsiyon, kompleks immobilize edilir oluşumu ya da kapsülleme, enzimatik işlemin 3,6 geliştirilmiş verimlilik ile elde edilmiş olmaktadır geniş yüzey-hacim ve enzim için alt-tabaka-oranları. immobilize reaktör diğer avantajları, MS analizinde enzimden otolitik ve parazit azalır enzim stabilitesi ve tekrar kullanılabilirliği geliştirilmiş bulunmaktadır. yaklaşımlar, cam ile ya da polimerik mikrofabrike cihaz çeşitli tarif edilmiştirantikor-antijen etkileşimleri, manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş enzimleri kullanılarak, 7,8 9 titanyum-alümina sol-jel 10 ve nanozeolites, 11 içinde kapsüllenmiş ya da Ni-NTA veya His-Tag kompleks oluşumu yoluyla çekilen altın nano partiküler ağlarında yakalanmış. 6 Alternatif immobilize enzimler ile açık boru şeklindeki kılcal damarlar, hem de geliştirilmiştir. 12 Dahası, gelişmiş proteolitik bölünme 30-120 reaksiyon sürelerini azaltmak için kontrollü mikrodalga ışıması 13 veya basınç destekli veya basınç çevrim teknolojisi (PCT) kullanılarak ortaya konmuştur min. 14
İmmobilize enzim reaktörlerin birden avantajlarına rağmen, ticari kartuş maliyetleri yüksek olduğu, rutin kullanım için mikroakışkan cihazların kullanılabilirliği sınırlıdır ve ek araçları için ihtiyaç mikrodalga veya PCT teknolojileri sonuçlarının kullanılması. Bu çalışmanın amacı, circumve bir yöntem geliştirmektiBu dezavantajların NTS ve kolayca dakika içinde MS analizi için hazırlık proteinlerin enzimatik bölünme gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yaklaşımla araştırmacılar güçlendirmek için, her laboratuarda uygulanabilir. yaklaşım kılcal ya da mikroakışkan cihaz önceden yüklenmiş olan hidrofobik, C18 partiküllerin kullanımına dayanır ve fazla enzimin infüzyonu sırasında enzimatik sindirme ile ve ardından bu parçacıklar üzerindeki ilgili protein (ler) adsorpsiyonu dolgulu yatak ve yakalanan protein (ler). Bu yaklaşımda, alt-tabaka kovalent olmayan etkileşimlerle hareketsizleştirilen edilir ve enzim hareketsiz hale getirilmiş proteine fazla demlenir. proteolitik sindirim verimliliği, enzimatik işlem, daha az ve parçacıkların yüzeyinden uzaklıkları ve yayılma süreleri için protein açığa büyük bir tanecik yüzey alanı artmıştır kütle transferi, enzim etkinliğine etki eden herhangi bir kovalent bağlanması, yeteneği artar hızla değerlendirme,Farklı enzimler, disposability ve çoğullama e kombinasyonları süreci mikroakışkan biçimde yürütülür ise. Bu yaklaşım, standart proteinler ve ESI-MS tespiti önce proteolitik sindirimi için tripsin en yaygın olarak kullanılan enzim karışımı kullanımı ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tespiti için kullanılan kütle spektrometresi doğrusal bir tuzak dört kutuplu (LTQ) enstrüman oldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada tarif mikroreaktör sağlayan kolay uygulanması en az 30 dakika, MS analizi ve tanılanması için proteinlerin enzimatik sindirim yapmak için deney düzeneği. Geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu sistemin farklı avantajları, basitlik, hız, düşük reaktif tüketimi ve düşük maliyetleri içerir. Özel olarak, pahalı bir hareketsiz tripsin boncuk ve kartuş için bir ihtiyaç vardır. Kılcal mikroreaktör hazırlanması basit (Şekil 1A), ve genel olarak, bir kromatografi lab…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Riferimenti
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
