Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
De overgrote meerderheid van massaspectrometrie (MS) -gebaseerde eiwitanalyse werkwijzen omvatten een enzymatische digestie stap voorafgaand aan detectie, typisch met trypsine. Deze stap is noodzakelijk voor het genereren van kleine moleculaire gewicht peptides, doorgaans MW <3000-4000 Da, dat binnen het effectieve scanbereik van massaspectrometrie instrumenten vallen. Gebruikelijke protocollen betrekking O / N enzymatische digestie op 37 ° C. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende strategieën, gewoonlijk met het gebruik van een microreactor met geïmmobiliseerde enzymen of een reeks aanvullende fysische processen die de tijd die voor proteolytische digestie reduceren tot een paar minuten (bijvoorbeeld magnetron of high- druk). In dit werk beschrijven we een eenvoudige en rendabele benadering die in elk laboratorium kan worden toegepast voor het bereiken van snelle enzymatische vertering van een proteïne. Het eiwit (of eiwit mengsel) wordt geadsorbeerd op C18-gebonden omgekeerde fase performance vloeistofchromatografie (HPLC) silicadeeltjes voorgeladen in een capillaire kolom en trypsine in waterige buffer wordt toegediend gedurende de deeltjes gedurende korte tijd. Om on-line MS detectie mogelijk te maken, worden de tryptische peptiden geëlueerd met een oplosmiddel systeem met een verhoogd gehalte aan organisch materiaal direct in het MS ionenbron. Deze aanpak vermijdt het gebruik van dure geïmmobiliseerde enzymdeeltjes en vereist niet geen steun voor voltooiing van het proces. Eiwitvertering en volledige monsteranalyse kan worden uitgevoerd in minder dan 3 min ~ en ~ 30 min, respectievelijk.
Introduction
De identificatie en karakterisering van gezuiverde eiwitten wordt vaak bereikt door MS technieken. Het eiwit wordt geknipt met een enzym en de peptiden worden verder geanalyseerd door MS via een eenvoudige infusie experimentele opstelling. Proteolytische digestie noodzakelijk voor het genereren van kleine peptidefragmenten die in de nuttige massabereik meeste MS analyzers vallen, en die gemakkelijk worden gefragmenteerd door lage botsenergie fragmentatie te aminozuursequentie informatie te genereren. Voor geïsoleerde eiwitten of eiwitmengsels eenvoudig, er geen verdere behoefte voor chromatografische scheiding van peptiden voorafgaand aan MS detectie. Een mengsel van 25-50 peptiden kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd door het inbrengen van het monster met een spuitpomp direct in het MS ionenbron.
De massaspectrometer kan de analyse uit te voeren en bevestig de sequentie van een eiwit binnen een kort tijdsbestek. Met moderne data-acquisitie methoden, kan dit proces worden bereikt wedurende enkele minuten of zelfs seconden. De beperkende factor bij het voltooien van het hele proces op een korte tijdschaal is de proteolytische vertering stap. Dit wordt typisch uitgevoerd gedurende enkele uren (of O / N) in oplossing bij 37 ° C met behulp van substraat: enzym verhoudingen van (50-100): 1. De enzymatische digestie tijd om minuten of seconden, geïmmobiliseerd enzym microreactoren Gewoonlijk verminderen, in de vorm van microfluïdische reactoren of commercieel verkrijgbaar cartridges, zijn beschreven. 1-6, wordt het enzym geïmmobiliseerd door covalente, niet-covalente / fysische adsorptie, complex formatie of inkapseling, 3,6 verhoogde de efficiëntie van het enzymatisch proces wordt mogelijk gemaakt door het grote oppervlak-tot-volume en enzym tot substraat verhouding. Bijkomende voordelen van geïmmobiliseerde reactoren onder verminderde autolyse en interferentie van het enzym in MS analyse verbeterde enzymstabiliteit en herbruikbaarheid. Een verscheidenheid van benaderingen, zoals glas of polymere microgefabriceerde inrichtingen zijn beschreven,gebruik enzymen geïmmobiliseerd op magnetische beads met antilichaam-antigen interacties 7,8 ingevangen in goud nanodeeltjes netwerken, 9 ingekapseld in titania-alumina sol-gels 10 en nanozeolites, 11 of gevangen met Ni-NTA en His-Tag complexvorming. 6 Alternatief , open buisvormige capillairen met geïmmobiliseerde enzymen zijn ontwikkeld en. 12 Bovendien verbeterde proteolytische splitsing werd aangetoond met gecontroleerde microgolfbestraling 13 of drukondersteunde of drukwisselingen technologie (PCT) om het reactietijden 30-120 min. 14
Ondanks de vele voordelen van geïmmobiliseerde enzym reactoren, de kosten voor commerciële cartridges is hoog, de beschikbaarheid van microfluïdische inrichtingen voor routinegebruik beperkt en het gebruik van microgolf of PCT technieken leidt tot behoefte aan extra apparatuur. Het doel van dit werk was om een methode te ontwikkelen die circumvents deze nadelen en die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in elk laboratorium onderzoekers machtigen met een eenvoudige en doeltreffende benadering voor het uitvoeren van enzymatische splitsing van eiwitten ter voorbereiding MS analyse binnen minuten. De benadering is gebaseerd op het gebruik van hydrofobe, C18-deeltjes die vooraf geïnstalleerd op een capillair of microfluïdische apparaat en de adsorptie van het eiwit (ten) van belang op deze deeltjes, gevolgd door enzymatische digestie tijdens de infusie van het enzym via gepakt bed en veroverde eiwit (s). In deze benadering wordt het substraat geïmmobiliseerd door niet-covalente interacties, en het enzym wordt toegediend via geïmmobiliseerde eiwit. De proteolytische digestie efficiëntie verhoogd met het grote deeltjesoppervlak gebieden die het eiwit enzymatische verwerking, verminderde afstanden en diffusie tijden en naar het oppervlak van de deeltjes bloot te leggen, verbeterde massaoverdracht, geen covalente binding die de activiteit van het enzym beïnvloeden, vermogen om snel evaluate combinaties van verschillende enzymen, disposability en multiplexing als het proces wordt uitgevoerd in een microfluïdische formaat. Deze aanpak wordt gedemonstreerd met behulp van een mengsel van standaard eiwitten en trypsine-de meest gebruikte enzym proteolytische digestie voorafgaand aan ESI-MS detectie. De massaspectrometer gebruikt voor detectie in deze studie was een lineair trap quadrupole (LTQ) instrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit werk beschreven microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische vertering van eiwitten MS analyse en identificatie in minder dan 30 minuten mogelijk. De duidelijke voordelen van dit systeem, in vergelijking met conventionele methoden, onder meer eenvoud, snelheid, laag reagensverbruik en lage kosten. In het bijzonder is er geen dure geïmmobiliseerd trypsine kralen en patronen. De bereiding van de capillaire microreactor is eenvoudig (figuu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Riferimenti
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
