Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
La gran mayoría de la espectrometría de masas (MS) a base de los métodos de análisis de proteínas implican una etapa de digestión enzimática antes de la detección, por lo general con tripsina. Este paso es necesario para la generación de péptidos de bajo peso molecular, generalmente con MW <3.000-4.000 Da, que caen dentro del rango de escaneado efectivo de la instrumentación de espectrometría de masas. protocolos convencionales implican la digestión enzimática O / N a 37 ºC. Los avances recientes han llevado al desarrollo de una variedad de estrategias, típicamente implica el uso de un microrreactor con enzimas inmovilizadas o de una serie de procesos físicos complementarios que reducen el tiempo necesario para la digestión proteolítica a unos pocos minutos (por ejemplo, de microondas o de alta presión). En este trabajo se describe un método sencillo y rentable que puede ser implementado en cualquier laboratorio para lograr la rápida digestión enzimática de una proteína. La proteína (o mezcla de proteínas) se adsorbe en alta perf de fase inversa C18-unidoormance partículas de sílice líquidos cromatografía (HPLC) precargados en una columna capilar, y tripsina en tampón acuoso se infunde a través de las partículas para un corto período de tiempo. Para habilitar la detección MS en línea, los péptidos trípticos se eluyen con un sistema disolvente con el aumento de contenido orgánico directamente en la fuente de MS de iones. Este enfoque evita el uso de partículas de alto precio enzima inmovilizada y no necesita ninguna ayuda para completar el proceso. La digestión de proteínas y análisis de la muestra completa se puede lograr en menos de 3 min y ~ ~ 30 min, respectivamente.
Introduction
La identificación y caracterización de las proteínas purificadas se consigue frecuentemente mediante el uso de técnicas de EM. La proteína se digiere con una enzima y sus péptidos se analizan además por MS mediante una sencilla configuración experimental de infusión. La digestión proteolítica es necesaria para la generación de pequeños fragmentos de péptidos que se encuentran en el rango de masa útil de la mayoría de los analizadores de MS, y que puede ser fácilmente fragmentado a través de baja energía de disociación inducida por colisión para generar información de la secuencia de aminoácidos. Para las proteínas aisladas o mezclas de proteínas simples, no hay más necesidad de la separación cromatográfica de péptidos antes de la detección EM. Una mezcla de 25-50 péptidos se puede analizar fácilmente mediante la infusión de la muestra con una bomba de jeringa directamente en la fuente de MS de iones.
El espectrómetro de masas puede llevar a cabo el análisis y confirmar la secuencia de una proteína en un breve espacio de tiempo. Con los métodos de adquisición de datos modernos, este proceso puede llevarse a cabo wentro de unos minutos o incluso segundos. El factor limitante en la realización de todo el proceso en una corta escala de tiempo es la etapa de digestión proteolítica. Por lo general, esto se realiza a través de un par de horas (o S / N), en solución, a 37 ºC, usando sustrato: proporciones de enzimas (50-100): 1. Para reducir el tiempo de digestión enzimática para minutos o segundos, microrreactores enzima inmovilizada, en forma de reactores de microfluidos o cartuchos disponibles en el mercado, se han descrito. 1-6 Típicamente, la enzima se inmoviliza por covalente, no covalente de adsorción / física, complejo la formación o la encapsulación, 3,6 la eficiencia mejorada del proceso enzimático ser habilitado por la gran superficie a volumen y las proporciones de enzima a sustrato. Otras ventajas de los reactores inmovilizados incluyen la autólisis y la interferencia reducidos de la enzima en el análisis de MS, la mejora de la estabilidad de la enzima y la reutilización. Se ha descrito una variedad de enfoques, el uso de vidrio o dispositivos microfabricados poliméricos,el uso de enzimas inmovilizadas sobre perlas magnéticas por las interacciones antígeno-anticuerpo, 7,8 atrapados en las redes de nanopartículas de oro, 9 encapsulado en titania-alúmina sol-geles 10 y nanozeolites, 11 o capturados a través de Ni-NTA o His-Tag la formación del complejo. 6 Alternativamente , se han desarrollado capilares abiertos-tubulares con enzimas inmovilizadas, también. 12 por otra parte, el aumento de la escisión proteolítica se ha demostrado mediante el uso de irradiación de microondas controlado 13 o tecnología bicicleta asistida por presión o presión (PCT) para la reducción de los tiempos de reacción a 30-120 min. 14
A pesar de las múltiples ventajas de los reactores de enzimas inmovilizados, los costos de los cartuchos comerciales es alta, la disponibilidad de dispositivos de microfluidos para uso rutinario es limitado, y el uso de los resultados de tecnologías de microondas o PCT en necesidad de instrumentación adicional. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método que circumveNTS estas desventajas, y que se puede implementar fácilmente en cada laboratorio para capacitar a los investigadores un método sencillo y eficaz para llevar a cabo la escisión enzimática de las proteínas en la preparación para el análisis de MS en cuestión de minutos. El enfoque se basa en el uso de hidrófobos, C18-partículas que son pre-cargados en un capilar o un dispositivo de microfluidos, y la adsorción de la proteína (s) de interés en estas partículas, seguido por digestión enzimática durante la infusión de la enzima sobre el lecho compacto y proteína (s) capturada. En este enfoque, el sustrato se inmoviliza a través de interacciones no covalentes, y la enzima se infunde a través de la proteína inmovilizada. La eficiencia de la digestión proteolítica se incrementa por las grandes áreas de superficie de partículas que exponen a la proteína para el procesamiento enzimático, distancias y tiempos de difusión hacia y desde la superficie de partículas reducido, una mejor transferencia de masa, no unión covalente que pueden afectar a la actividad de la enzima, la capacidad de forma rápida evaluate combinaciones de diferentes enzimas, disponibilidad de acceso, y la multiplexación si el proceso se ejecuta en un formato de microfluidos. Este enfoque se demuestra con el uso de una mezcla de proteínas estándar y de tipo tripsina de la enzima más utilizada para la digestión proteolítica antes de la detección ESI-MS. El espectrómetro de masas utilizado para la detección en este estudio fue un instrumento lineal trampa cuadrupolo (LTQ).
Protocol
Representative Results
Discussion
El micro-reactor descrito en este trabajo proporciona una forma fácil de implementar montaje experimental para llevar a cabo la digestión enzimática de las proteínas para permitir el análisis de MS y la identificación en menos de 30 minutos. Las ventajas de este sistema, en comparación con los enfoques convencionales, incluyen la simplicidad, velocidad, bajo consumo de reactivo y bajos costos. En particular, no hay necesidad de perlas de tripsina inmovilizada caros y cartuchos. La preparación del microrreactor c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
Riferimenti
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
