High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
De kunst van het produceren van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties is een grote uitdaging voor studies van de structuur en functie. De snelle vaststelling en hoge herstel van transiënt getransfecteerde zoogdiercellijnen richt deze barrière en is een effectieve manier tot expressie eiwitten die van nature via de ER en Golgi-gemedieerde secretorische pathway. Hier is een protocol voor het eiwit expressie met behulp van het menselijk HEK293F en HEK293S cellijnen getransfecteerd met een zoogdierexpressievector ontworpen voor hoge eiwit opbrengsten. De toepasbaarheid van dit systeem wordt aangetoond met behulp van drie representatieve glycoproteïnen die uitgedrukt met opbrengsten tussen 95-120 mg van het gezuiverde eiwit teruggevonden per liter cultuur. Deze eiwitten zijn de menselijke FcγRIIIa en rat α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, beide uitgedrukt met een N-eindstandige GFP fusie, alsook ongemodificeerd menselijk immunoglobuline G1 Fc. Deze robuuste systeem utilizes een serumvrij medium dat is aangepast voor expressie van isotopisch verrijkte eiwitten en koolhydraten structurele studies met massaspectrometrie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Verder kan de samenstelling van de N-glycan worden afgesteld door toevoeging van een kleine molecule bepaalde glycaan wijzigingen voorkomen op een wijze die de opbrengst vermindert.
Introduction
Het produceren van hoge opbrengsten van de juiste gevouwen en post-translationeel gemodificeerde menselijke eiwitten voor een gedetailleerde analyse van de structuur en functie blijft een belangrijke uitdaging. Een groot aantal expressiesystemen beschikbaar die recombinante eiwitten met natief-achtige en gedrag produceren. Bacteriële expressiesystemen, voornamelijk Escherichia coli-stammen, zijn de meest toegankelijke en gebruikte gereedschappen in de onderzoeksarena, vanwege de eenvoud van deze expressiesystemen, ofschoon gist, plant, insect en zoogdier systemen zijn ook beschreven 04/01. Het merendeel van deze systemen zijn niet in staat geschikte posttranslationele modificatie van de doeleiwitten. Een fundamenteel belang van de Barb en Moremen laboratoria is het produceren van eukaryote eiwitten met de juiste glycosylering. Veel menselijke eiwitten nodig passende glycosylering voor de juiste functie (zie 5).
De eukaryotischeglycosyleringsmachinerie is uitgebreid en in staat om een uiteenlopende modificaties, zowel asparagine (N) – en serine / threonine (O) complex-gebonden glycanen 6. Geschat wordt dat> 50% van humane eiwitten N-geglycosyleerd 7. Glycanen essentiële componenten van verschillende proteïnen, waaronder therapeutische monoklonale antilichamen, erytropoëtine en bloedstollingsfactoren zoals factor IX, om een paar te noemen. Hoewel meerdere methoden bestaan om de juiste N-geglycosyleerde eiwitten te bereiden en variëren van puur synthetische 8-10, om chemoenzymatic 11-14 of herstel van ontworpen recombinante systemen 15-20, niet verrassend, menselijke expressie systemen hebben tot nu toe bewezen de meest robuust werkwijzen voor het genereren van humane eiwitten.
Veel therapeutische humane glycoproteïnen worden geproduceerd in recombinante systemen die gebruik zoogdiercellen. Systemen van de nota zijn de Chinese hamster ovarium (CHO), muis myeloom (NS0), baby hamster kidney (BHK), humane embryonale nier (HEK-293) en menselijke netvlies cellijnen die werkzaam zijn in de hechting of opschorting cultuur eiwitproductie 4,21,22. Echter, zoogdieren eiwitexpressiesystemen het genereren van stabiele cellijnen, dure kweekmedia en substraat geassisteerde transfectie procedures 23 vereist.
Zoogdiercel transfectie wordt bereikt met behulp van talrijke middelen zoals calciumfosfaten 24,25, kationische polymeren (DEAE-dextran, polybreen, polylysine, polyethylimine (PEI)) of positief geladen kationische liposomen 26-29. PEI is een polykationisch, geladen, lineair of vertakt polymeer (25 kDa) 26 dat een stabiel complex vormt met DNA en endocytose. Na aanzuren van het endosoom wordt PEI gedacht te zwellen, waardoor de scheuring van endosomen en afgifte van het DNA in het cytoplasma 26,30.
Tot voor kort, voorbijgaande transfectie in suspensiop kweek werd uitgevoerd door voorafgaande DNA / PEI complexvorming, gevolgd door toevoeging aan de 29 celkweek. Echter, Würm en medewerkers rapporteerden een zeer efficiënt protocol geoptimaliseerd voor recombinante eiwitproductie in HEK293 cellen die een DNA / PEI complex in situ 31,32 gevormd. Deze vermeden voorbereiding, sterilisatie van het complex, en de buffer te wisselen in een kweekmedium. Verdere optimalisatie door het opnemen van expressie verbeteren van plasmiden heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de opbrengst 33. Hierin is een methode die voortbouwt op deze vooruitgang en is breed toepasbaar. Expressie mogen ook worden gewijzigd volgens de N-glycan samenstelling beïnvloeden.
De HEK293S cellijn met een gen deletie die N-glycan verwerking in een tussenstadium stopt, leidt tot de expressie van eiwitten met uniforme N-glycanen bestaande uit 2 N-acetylglucosamineresten plus vijf mannose residuen (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Deze cellenmissen het N-acetylglucosaminyl transferase I (GNTI) gen dat vereist is voor stroomafwaartse N-glycan verwerkende 36,37. Het gebruik van glycosyltransferase-remmers waaronder kifunensine, siaalzuur analogen en fucose analoge en 2-deoxy-2-fluor-fucose gelijksoortige gevolgen en beperkingen N-glycan verwerkende 38-41.
Het protocol hier gerapporteerde gebruikt pGEn2 vector zoals getoond in figuur 1 42,43, PEI bijgestaan transiënte transfectie in zoogdiercellen leidingen (HEK293F HEK293S of cellen) en de terugwinning van hoge opbrengsten op passende geglycosyleerd eiwit. Dit systeem is robuust en is geschikt voor diverse factoren, waaronder isotopen en glycan techniek voor de productie van grote titers van recombinante eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol illustreert eiwitexpressie via transiënte transfectie van HEK293F of S cellen. De in de Barb en Moremen labs opgericht optimale transfectie voorwaarden gebruik van een kritische combinatie van celdichtheid en reagensconcentraties hoog rendement transfectie te bereiken. Kritische overwegingen bij de uitvoering van dit protocol zijn onder andere: het behoud van een stabiele cultuur voor transfectie (met consistente cultuur verdubbeling keer); transfectie van actief groeiende cellen (verdunning cellen tot 1 x…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidies K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) en P01GM107012 (KWM) van de National Institutes of Health, en door fondsen van de Roy J. Carver Afdeling Biochemie, Biofysica & Moleculaire Biologie aan de Iowa State University . De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
Riferimenti
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochimica. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochimica. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochimica. 54 (2), 313-322 (2015).
