Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.
Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способны соответствующим посттрансляционной модификации белков-мишеней. Фундаментальный интерес лабораториях Барб и Moremen производит эукариотических белков с соответствующей гликозилирования. Многие белки человека требуют соответствующего гликозилирования для правильного функционирования (см 5).
Эукариотическийгликозилирования техника обширна и способны сделать широкий спектр модификаций, в том числе как аспарагин (N) – и серина / треонина (О) -связанной сложные гликаны 6. Считается, что> 50% человеческих белков N-гликозилированные 7. Гликаны являются важными компонентами многих белков, включая терапевтические моноклональные антитела, эритропоэтин, и факторов свертывания крови, как фактор IX, чтобы назвать несколько. Хотя несколько методов существуют, чтобы подготовить соответствующим образом N-гликозилирования белков и варьируются от чисто синтетических 8-10, чтобы chemoenzymatic 11-14 или восстановление из инженерных рекомбинантных системах 15-20, не удивительно, что системы человека выражение до сих пор доказано, что самый надежный методы для генерации человеческих белков.
Многие терапевтические человека гликопротеины производятся в рекомбинантных системах, использующих клетки млекопитающих. Системы следует отметить яичника китайского хомячка (СНО), мышиной миеломы (ns0), хомячка Kidneу (ВНК), человеческого эмбриона почек (НЕК-293) и сетчатки клеточных линий человека, которые используются в адгезии или суспензионной культуры для производства белка 4,21,22. Тем не менее, системы экспрессии белка млекопитающего требовали генерацию стабильных клеточных линий, дорогих питательной среды и подложки помощь процедур трансфекции 23.
Млекопитающих трансфекции клеток достигается с помощью многочисленных агентов, включая фосфатов кальция 24,25, катионных полимеров (DEAE-декстран, полибрен, полилизин, polyethylimine (PEI)) или положительно заряженных катионные липосомы 26-29. PEI является поликатионное, загружают, линейный или разветвленный полимер (25 кДа), который формирует 26 стабильный комплекс с ДНК и эндоцитоз. При подкислении эндосомы, PEI, как полагают, набухают, что приводит к разрыву эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму 26,30.
До недавнего времени, временная трансфекция в suspensiна культуру проводилась по предварительной ДНК / PEI комплексообразования с последующим добавлением к культуре клеток 29. Тем не менее, Würm и соавторы сообщили весьма эффективный протокол, оптимизированный для рекомбинантного белка в клетках НЕК293, которые сформировали комплекс ДНК / PEI в месте 31,32. Это препарат, избежать стерилизации комплекса, и буфера обмена в культуральной среде. Дальнейшая оптимизация путем включения экспрессии плазмиды, повышающих привели к значительным увеличением доходности 33. В этом метод, который основывается на этих авансов и широко применим. Условия экспрессии также могут быть изменены, чтобы повлиять на состав N-гликанов.
Клеточная линия HEK293S, с делеции гена, что останавливает N-гликана обработки на промежуточном этапе, приводит к экспрессии белков с единых N-гликанов, состоящих из 2 N-ацетилглюкозамина остатков плюс пять остатков маннозы (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Эти клеткине хватает N-ацетилглюкозаминил трансферазы I (GntI) ген, который требуется для последующего N-гликанов обработки 36,37. Применение ингибиторов гликозилтрансферазы включая kifunensine, аналогов сиаловой кислоты и фукозы аналоговых и 2-дезокси-2-фтор-фукозы имеет подобные эффекты и ограничения N-гликанов обработки 38-41.
Протокол сообщалось здесь, использует вектор pGEn2, как показано на рисунке 1 42,43, PEI трансфекции помощь переходные в клетки линий (HEK293F или HEK293S клеток), а также восстановление с высоким выходом соответственно гликозилированный белок. Эта система является надежной и может использоваться для различных факторов, включая изотопной метки и гликановой техники для производства больших титров рекомбинантных белков.
Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективн?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
Glycerol | SIGMA | G5516 | |
Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |