באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה
Summary
אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
III מערכות סוג ההפרשה (T3SS) הן גורמי אלימות חיוניים לפתוגנים גראם שלילי רבים. Injectisome, הידוע גם במתחם המחט, הוא המכונה T3SS המרכזית הנדרשת לטרנסלוקציה הישירה של חלבוני מפעיל מהחיידק לתאי מארח אוקריוטים 1, 2. Injectisome כולל מחט תאית, גוף בסיסי, ומורכב cytoplasmic גם ידוע כמורכב מיון 3. מחקרים קודמים הובהרו מבני 3-D של injectisomes המטוהר מסלמונלה וShigella, יחד עם המבנים האטומיים של חלבוני גוף בסיסיים גדולים 4, 5. אחרונים במבנים באתרו של injectisomes מסלמונלה, Shigella, וYersinia נחשפו על ידי cryo-ET 6 , 7. עם זאת, מורכב cytoplasmic, חיוני לבחירת מפעיל והרכבת מחט, לא דמיינו במבנים אלה.
קריו ET הוא most טכניקה מתאימה להדמיה מולקולרית מכונות ברזולוציה ננומטר בתוך הקשרה המקורי הסלולרי (באתר). עם זאת, החלטת השגה על ידי cryo-ET מוגבל על ידי עובי דגימה. כדי להתגבר על החסרון, שצלמנו injectisomes שלם במתח flexneri ארסי Shigella שמהונדס גנטי כדי לייצר minicells רזה מספיק cryo-ET. מגבלה נוספת של cryo-ET היא הרגישות של המדגם לקרינה הנגרמת על ידי קרן האלקטרונים, שהורס את המידע ברזולוציה הגבוהה במדגם מהר מאוד. כתוצאה מכך, במינונים נמוכים מאוד משמשים להטיה-תמונות בודדות, כך שמינון מתאים יכול להיות מופץ בקרב ההטיה-הסדרה המלאה. זה מוריד את יחס אות לרעש (SNR) בשחזור הגמר, מה שהופך את זה קשה להבחין תכונות המבניות של הנושא מהכמות הגדולה של רעש בtomogram ומגביל את הרזולוציה שיכול להיות מושגת על ידי הוצאה מחדר הקפאה מאוד ET. Conventiעיבוד תמונת onal כגון פורייה ומסננים אמיתיים-חלל כמו גם את הדגימה ניתן להשתמש כדי להגביר את הניגודיות, אבל על חשבון סינון הרבה של המידע ברזולוציה הגבוהה. לאחרונה, מיצוע תת-tomogram איפשר להגדיל באופן משמעותי את יחס האות לרעש ולאחר מכן ההחלטה הסופית במקרים מסוימים לרמות תת-ננומטר 8, 9. ניתוח מפורט יותר של מתחמים מתאפשר על ידי המחשוב חילוץ אלפי תת-tomograms מכיל תחומי העניין מtomograms המקורי ולאחר מכן יישור וממוצע תת-tomograms לקבוע במבנים מורכבים אתר עם יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה גבוהה יותר. ניתן לשלב שיטות אלה עם גישות גנטיות לספק תובנות גדולות עוד יותר למכלולי macromolecular והתצורות הדינמיות שלהם בהקשר הסלולרי המקומי.
באופן כללי, עשרות או אפילו מאות אלף תת-tomograms צריכים להיות בממוצע על מנת לקבוע גבוהמבני -resolution באתר. הרכישה של מספר מספיק הטיה-סדרה של דרושה כדי לייצר מספר רב של תת-tomograms הופך לצוואר בקבוק במהירות. הטיה-הסדרה וכתוצאה מכך מושפעת לעתים שינוי מושרה קרן, תגובה חריפה שלב, כמו גם הגדלה, סיבוב והטית פגמים, שיש לפתור כדי להביא את ההטיה-הסדרה ליישור לפני השחזור. סדרת ההטיה מיושרת בדרך כלל על ידי סמני מעקב זהב fiducial, אשר נבחרו באופן מסורתי באופן ידני באמצעות בדיקה של ההטיה-הסדרה, וגרמו עוד צוואר בקבוק. חבילות תוכנה רבות פותחו עבור רכישת הטיה-סדרה אוטומטית באמצעות מיקרוסקופים מבוקרים מחשב אלקטרונים 10, 11, 12, יישור הטיה-סדרה ושחזור 13, 14 ותת-tomogram ממוצע 15-18. חבילות אלה להתמודד עם פעולות בדידות בזרימת העבודה של cryo-ET, הוא הופך להיות רצוי לבנות רמה גבוהה יותר של הפשטה בתהליך לSystematically לייעל את כל התכנית לצינור אחד. לכן, פיתחנו ספריית עטיפת תוכנה "tomoauto" שנועדה לארגן מספר החבילות אלה ליחידה חצי אוטומטי יחידה, המאפשר למבצע משתמש פשוט, תוך שמירה על תצורה מלאה של כל רכיב באופן ריכוזי. הספרייה היא קוד פתוח, מתועד היטב, שפותח ללא הרף וזמין באופן חופשי לשימוש, פיתוח מותאם או אינטגרציה נוספת באמצעות מאגר קוד מקור מרוחק מקוון (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
צינור cryo-ET תפוקה גבוהה זה נוצל כדי להמחיש injectisomes שלם בס minicells flexneri. סך של 1,917 tomograms נוצרו בשיטה זו, חושף ברזולוציה גבוהה במבנה אתר של המכונה ללא פגע כולל פלטפורמת מיון cytoplasmic נקבעה על ידי משנה tomogram ממוצע 19. יחד עם הדמיה מולקולרית של wild-type ומטרמכונות utant, צינור התפוקה גבוהה שלנו מספקת דרך חדשה להבין את המבנה ותפקוד של injectisome שלם בהקשר הסלולרי המקומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת התפוקה גבוהה המתוארות כאן אפשרה לנו להטות סדרת 1,917 cryo לעבד ולייצר מעל 4,500 תת-tomograms של ס 'שלם flexneri injectisome 19. הנתונים שנאספו הובילו לאפיון מפורט של בinjectisome אתר, לרבות cytoplasmic מיון מורכב. השיטה נוצלה גם כדי להמחיש כמה תאים שעברו מוטציה עם מחיקה ספצ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ויליאם מרגולין להערות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה בSerialEM מבני הזוג. דוד Mastronarde וחן שו. DM, BH וJL נתמכו על ידי גרנט R01AI087946 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מענקי R01GM110243 וR01GM107629 מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (NIGMS), וגרנט AU-1,714 מהקרן וולש. גלאי האלקטרונים הישירים מומנו על ידי המכון הלאומי לבריאות בפרס S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Riferimenti
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
