Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica
Summary
Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Tipo III sistemas de secreción (T3SS) son determinantes de virulencia esenciales para muchos patógenos Gram-negativas. El injectisome, también conocido como el complejo de la aguja, es la máquina T3SS centro requerida para la translocación directa de proteínas efectoras de la bacteria en las células huésped eucariotas 1, 2. El injectisome comprende una aguja extracelular, un cuerpo basal, y un complejo citoplásmico también conocida como el complejo de clasificación 3. Estudios previos han dilucidado estructuras 3-D de injectisomes purificados de Salmonella y Shigella, junto con las estructuras atómicas de las principales proteínas del cuerpo basal de 4, 5. Recientes en las estructuras in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella y Yersinia fueron revelados por crio-ET 6 , 7. Sin embargo, el complejo citoplasmático, esencial para la selección efector y conjunto de la aguja, no se ha visualizado en esas estructuras.
Cryo-ET es los mesest técnica adecuada para obtener imágenes de la maquinaria molecular a una resolución de nanómetros dentro de su contexto celular nativo (in situ). Sin embargo, la resolución alcanzable por crio-ET está limitada por espesor de la probeta. Para superar el inconveniente, hemos fotografiado injectisomes intactas en una cepa de Shigella flexneri virulenta que fue modificada genéticamente para producir minicélulas lo suficientemente delgadas para crio-ET. Otra limitación de la crio-ET es la sensibilidad de la muestra a la radiación inducida por el haz de electrones, que destruye muy rápidamente la información de alta resolución en la muestra. Como resultado, las dosis extremadamente bajas se utilizan para Tilt-imágenes individuales de manera que una dosis adecuada puede ser distribuido entre la inclinación de la serie completa. Esto reduce en gran medida la relación señal-ruido (SNR) en la reconstrucción final, lo que hace difícil diferenciar las características estructurales de la materia a partir de la gran cantidad de ruido en la tomografía y limita la resolución que se puede lograr por crio ET. Conventional de procesamiento de imágenes tales como Fourier y los filtros del espacio real así como hacia abajo de muestreo se puede utilizar para aumentar el contraste, pero a expensas de filtrar gran parte de la información de alta resolución. Recientemente, sub-tomografía promedio ha permitido aumentar enormemente la SNR y, posteriormente, la resolución final en algunos casos a niveles sub-nanómetros 8, 9. Un análisis más detallado de los complejos es posible gracias computacionalmente extraer miles de sub-tomografías contienen las áreas de interés de las tomografías originales y luego alinear y promedio de las sub-tomografías para determinar en estructuras complejas situ con mayor SNR y mayor resolución. Estos métodos se pueden integrar con enfoques genéticos para ofrecer aún mayores conocimientos sobre las asambleas macromoleculares y sus conformaciones dinámicas en el contexto celular nativo.
En general, decenas o incluso cientos de miles de sub-tomografías deben ser promediados para determinar altaestructuras -Resolución in situ. La adquisición de un número suficiente de inclinación de la serie necesaria para producir este gran número de sub-tomografías rápidamente se convierte en un cuello de botella. La inclinación de la serie resultantes son a menudo afectada por el cambio inducido por haz de, etapa reacción, así como la ampliación, la rotación y defectos de inclinación, que debe resolverse para que la inclinación de la serie en alineación antes de la reconstrucción. La serie de inclinación está normalmente alineado por el seguimiento de marcadores de referencia de oro, que son seleccionados tradicionalmente manualmente a través de la inspección de la serie de inclinación, causando otro cuello de botella. Muchos paquetes de software se han desarrollado para la adquisición de la inclinación de la serie automatizada a través de microscopios electrónicos controlados por el ordenador 10, 11, 12, la alineación de inclinación de la serie y la reconstrucción de 13, 14 y sub-tomografía promedio de 15 a 18. Como estos paquetes manejan operaciones discretas en el flujo de trabajo de la crio-ET, se hace deseable construir un mayor nivel de abstracción en el proceso para systematicamente agilizar todo el esquema en una sola tubería. Por lo tanto, hemos desarrollado una biblioteca envoltorio software "tomoauto" diseñado para organizar una serie de estos paquetes en una sola unidad semi-automatizado, permitiendo una operación de usuario simple, mientras que el mantenimiento de la configuración completa de cada componente de forma centralizada. La biblioteca es de código abierto, bien documentado, desarrollado continuamente y libremente disponibles para su uso, desarrollo a medida o una mayor integración por medio de un código fuente remota repositorio en línea (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Este crio-ET tubería de alto rendimiento se ha utilizado para visualizar injectisomes intactos en S. minicélulas flexneri. Un total de 1.917 tomografías fueron generados usando este método, revelando una alta resolución en la estructura in situ de la máquina intacta incluyendo la plataforma de clasificación citoplasmática determinado por sub-tomografía promediando 19. Junto con el modelado molecular de tipo salvaje y mmáquinas utant, nuestra línea de alto rendimiento proporciona una nueva vía para entender la estructura y la función del injectisome intacto en el contexto celular nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El alto rendimiento método descrito aquí nos permitió procesar 1,917 crio tilt-serie y producir más de 4.500 sub-tomografías del S. intacta flexneri injectisome 19. Los datos obtenidos llevaron a la caracterización detallada de en injectisome situ, incluyendo el citoplasmática de clasificación compleja. El método también se utilizó para visualizar varias células mutantes con deleción específica de los componentes de proteína putativa, que ayudó a di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. William Margolin para comentarios. Estamos muy agradecidos por el apoyo de SerialEM de los Dres. David Mastronarde y Chen Xu. DM, BH y JL fueron apoyados por Grant R01AI087946 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Becas R01GM110243 y R01GM107629 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), y Grant AU-1714 de la Fundación Welch. El detector de electrones directa fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Premio S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Riferimenti
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
