Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Typ III-Sekretion Systeme (T3SS) sind wesentliche Virulenzdeterminanten für viele gramnegative Krankheitserreger. Die Injektisoms, auch bekannt als die Nadel-Komplex bekannt ist, ist die zentrale T3SS Maschine für direkte Translokation von Effektor-Proteine aus dem Bakterium in eukaryotischen Wirtszellen 1, 2 erforderlich. Die Injektisoms umfasst eine extrazelluläre Nadel, ein Basaltemperatur und einen zytoplasmatischen Komplex ebenfalls bekannt als Sortierkomplexe 3. Frühere Studien haben 3-D-Strukturen von gereinigtem injectisomes aus Salmonella und Shigella erläutert, zusammen mit den atomaren Strukturen der Haupt Basaltemperatur Proteinen 4, 5. Jüngste in situ Strukturen injectisomes aus Salmonella, Shigella und Yersinia wurden enthüllt Kryo-ET 6 , 7. Jedoch ist die cytoplasmatische Komplexes wesentlich für Effektorzellen Auswahl und Nadelbaugruppe, nicht in diesen Strukturen sichtbar gemacht.
Cryo-ET wird der MOS-t geeignete Technik für die Bildgebung molekulare Maschinerie in Nanometer-Auflösung in seiner nativen zellulären Kontext (in situ). Dennoch ist die erreichbare Auflösung durch Kryo-ET von Probendicke begrenzt. Um den Nachteil zu überwinden, bebildert wir intakte injectisomes in einem virulenten Shigella flexneri Stamm, der genetisch veränderten wurde auf Minizellen dünn genug für die Kryo-ET zu produzieren. Eine weitere Einschränkung der Kryo-ET ist die Empfindlichkeit der Probe auf die Strahlung von dem Elektronenstrahl, die sehr schnell zerstört die Information hoher Auflösung in der Probe induziert wird. Als Ergebnis sind extrem niedrige Dosen für einzelne neigungsBilder verwendet, so daß eine geeignete Dosis kann unter der vollen Neigungsreihe verteilt sein. Dies das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in der endgültigen Rekonstruktion, wodurch es schwierig ist, die strukturellen Merkmale des Gegen aus der großen Menge von Rauschen in dem Tomogramm zu differenzieren und begrenzt die Auflösung, die durch Kryo- erzielbaren senkt erheblich ET. Conventional Bildverarbeitung wie Fourier und Realraumfilter sowie Abwärtsabtasten kann verwendet werden, um den Kontrast zu erhöhen, aber auf Kosten der Ausfilterung viel von der Information hoher Auflösung. In jüngerer Zeit hat Unter Tomogramm Lungs machte es möglich, stark zu erhöhen das SNR und anschließend die endgültige Lösung in einigen Fällen auf Sub-Nanometerstufen 8, 9. Eine detailliertere Analyse von Komplexen ermöglicht wird durch rechen Extrahieren Tausende von Teilschnittbildern, enthaltend die Bereiche von Interesse von den ursprünglichen Schichtaufnahmen und dann Ausrichten und Mittelwertbildung der Teilschnittbilder di situ komplexe Strukturen mit höherer SNR und eine höhere Auflösung zu bestimmen. Diese Verfahren können mit genetischen Methoden noch größere Einblicke in die makromolekularen Anordnungen und ihre dynamischen Konformationen in der nativen zellulären Kontext bereitzustellen integriert werden.
In der Regel Dutzende oder sogar Hunderte von tausend Unterschichtaufnahmen müssen, um zu bestimmen, Hoch gemittelt werden-Auflösung Strukturen in situ. Die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Tilt-Serie erforderlich, um zu produzieren diese große Anzahl von Unterschichtaufnahmen schnell zu einem Engpass. Die sich ergebende Tilt-Serie werden häufig durch strahlinduzierte Verschiebung der Bühne spiel sowie Vergrößerung, Rotation und Schräg Mängel, die gelöst werden müssen, um die Neigung der Serie in eine Ausrichtung vor der Rekonstruktion zu bringen betroffen. Der Neigungsserie wird in der Regel durch die Verfolgung Goldbezugsmarkierungen, die traditionell von Hand durch Inspektion des Tilt-Reihe ausgewählt sind, wodurch eine weitere Flaschenhals ausgerichtet sind. Viele Software-Pakete für die automatisierte Tilt-Serie Nahme durch computergesteuerte Elektronenmikroskopen 10, 11, 12, Tilt-Serie Ausrichtung und Wiederaufbau 13, 14 und Unterschichtaufnahme von durchschnittlich 15 bis 18 entwickelt. Da diese Pakete hand diskreten Operationen in den Workflow der Kryo-ET, wird es wünschenswert, einen höheren Abstraktionsebene in den Prozess zu systema bauendas gesamte Schema tisch zu optimieren zu einer einzigen Pipeline. Daher entwickelten wir eine Software-Wrapper-Bibliothek "tomoauto" entwickelt, um eine Reihe von diesen Paketen in einem einzigen halbautomatische Einheit zu organisieren, so dass für einfache User-Betrieb bei voller Konfiguration jeder Komponente in einer zentralisierten Weise. Die Bibliothek ist Open-Source, gut dokumentiert, fortlaufend entwickelt und für den Einsatz frei verfügbar, maßgeschneiderte Entwicklung oder die weitere Integration mit Hilfe eines Online-Remote-Quellcode-Repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Dieses High-Throughput-Kryo-ET Leitung wurde verwendet, um intakt injectisomes di S. visualisieren flexneri Minizellen. Insgesamt 1.917 Schichtaufnahmen wurden mit dieser Methode erzeugt werden, offenbart eine hochauflösende in situ Struktur des intakten Maschine einschließlich der zytoplasmatischen Sortierplattform von Unterschichtaufnahme von durchschnittlich 19 bestimmt. Zusammen mit Molecular Modeling von Wildtyp und mutant Maschinen, bietet unser Hochdurchsatz-Pipeline einen neuen Weg, um den Aufbau und die Funktion des intakten Injektisoms im nativen zellulären Kontext zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren mit hohem Durchsatz konnten wir 1917 Kryo-Tilt-Serie verarbeiten und produzieren über 4.500 Unterschichtaufnahmen des intakten S. flexneri Injektisoms 19. Die gesammelten Daten führten zur detaillierten Charakterisierung von in situ Injektisoms, einschließlich der zytoplasmatischen Sortierkomplexe. Das Verfahren wurde auch verwendet, um mehrere mutante Zellen mit spezifischen Deletion des mutmaßlichen Protein-Komponenten, erläutern die Zusammense…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. William Margolin für Kommentare. Wir sind dankbar für die Unterstützung auf SerialEM aus Drs. David Mastronarde und Chen Xu. DM, BH und JL wurden von Grant R01AI087946 aus dem Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, Grants R01GM110243 und R01GM107629 vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), und Grant AU-1714 von der Welch Foundation unterstützt. Die direkte Elektronendetektor wurde vom National Institutes of Health Award S10OD016279 finanziert.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Riferimenti
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