Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en förlust- och förstärkningsfunktionsmetod som är tillämplig för att identifiera neogenin som en scen-specifik receptor som leder till trophectoderm och inre cellmassan differentiering i embryon preimplantatorisk mus.
Introduction
Preimplantatorisk embryonal utveckling kan delas in i flera olika etapper, från en-cellstadiet till morula och blastocyst. Mycket bevis tyder på att polariteten och positionella signaler spela en roll i tidig determinering in trophectoderm (TE) och den inre cellmassan (ICM). Dock arten av de signaler, hur de är omvandlade till cellulära signaler, och de fysiologiska sammanhang där sådana signaler är i stånd att initiera cellhärstamning differentiering är inte kända. Dessa differentierade celler genomgå sedan specialisering, börjar ta på karakteristiska strukturer och funktioner som behövs för embryo korrekt bildning och tillväxt av moderkakan 1-3.
Preimplantatorisk embryon är särskilt mottagliga för manipulation genom direkt injektion av modifierade genetiskt material som siRNA eller mål-cDNA och därför kan användas för att studera specifika målmolekyler. Det finns en växande insikt om att genetiskanalys av ryggradsdjur embryon är avgörande för att öka kunskaperna om embryonal utveckling 4. Exakt införande av en vildtyp-gen eller en muterad form i ett embryo i tid sammanhang att åstadkomma GAIN- eller förlust-av-funktion av genen har i hög grad underlättat studier av utvecklingsmässigt reglerade gener. Förlust- och få-av-funktion via mikroinjektion av genetiskt material till individuella tidiga icke-däggdjur och däggdjurs embryon är relativt enkelt på grund av sin storlek och stor mottaglighet 5. Mikroinjektion utförs typiskt med användning av icke-virala vektorer. Särskild fördel har tagits av den enkla att använda icke-virala vektorer över virala vektorer och transgener. En snabb förlust eller vinst-of-funktionsuttryck systemet musembryon har utvecklats som gör det möjligt för oss att dissekera och förstå genfunktioner i ryggradsdjur embryologi 6,7.
Fluorescensmärkning av embryon skulle i hög grad underlätta valet av microinjected eller genetiskt manipulerade embryon och samtidigt ge ett medel för att indirekt kvantifiera uttrycksnivån för mikroinjiceras siRNA eller cDNA baserat på fluorescensintensitet 8. För att åstadkomma detta märkning, fluorescerande protein cDNA, GFP eller RFP, samar injiceras som antingen fusionskonstruktioner eller separat. Fluorescensintensiteten hos GFP eller RFP avslöjar graden av uttryck av siRNA eller främmande DNA för att säkerställa att förlust- eller vinna-of-funktion har uppnåtts.
Här presenterar vi en mikromanipulation protokoll för förlust och vinst-of-funktion teknik som tillät oss att identifiera neogenin som en receptor som förmedlar extracellulära signaler viktiga i början av celldifferentiering i embryon preimplantatorisk mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden för djuruppfödning och bekymmer genomfördes i enlighet med IACUC förordningar Sahmyook University, Seoul, Sydkorea.
1. Superovulation, Avel och äggledare Isolering
- Upprätthålla inavlade C57BL / 6 möss under följande betingelser: 22 ± 3 ° C, ~ 60% fuktighet, 12 timmar ljus / mörker-cykel, och vatten och mat ad libitum.
- Inducera superovulation av 3-5 veckor gamla honmöss av en intraperitoneal injektion av 5 lU gravid sto serumgonadotropin (PMSG) vid 0,1 ml / huvud följt 48 h senare genom en intraperitoneal injektion av 5 lU humant koriongonadotropin (hCG) på 0.1 ml /huvud.
- Omedelbart efter hCG-injektionen, mate superovulation-inducerade honor med könsmogna hanar av samma stam genom att hålla dem i samma bur natten.
- Nästa morgon, bekräftar framgångsrik parning genom närvaro av en passande plugg eller vaginal plugg på den kvinnliga könsorgan.
- Offra gravid honmössav CO2 förgiftning följt av halsdislokation 18-20 timmar efter hCG-injektionen.
- Öppna bukhålan genom att skära huden och sedan den peritoneala skiktet med fina saxar.
- Plocka upp livmoderhornen med fin pincett och dra bort livmodern, äggledare, äggstockar och fettkudden försiktigt från kroppshåligheten.
- Skär området mellan äggledaren och äggstocken med fina sax. Placera om pincett och skär livmodern nära äggledaren, vilket lämnar åtminstone 1 cm från den övre delen av livmodern bifogas.
- Överföra oviductal ampulla till en 35 mm petriskål innehållande M16-medium vid rumstemperatur. Pool äggledarna från flera möss i samma skålen.
- Placera skålarna under ett stereomikroskop för hämtning av embryon.
2. Hämtning och kultur av 2-pronukleär (2-PN) Embryon
- Skär i slutet av en 30 eller 32 G injektionsnål, mala det i en trubbig spets, och använda den som en spolning nål.
- Användningfin pincett för att glida i slutet av äggledaren på spolningsnålen. Tryck försiktigt spetsen av spolningsnålen mot botten av skålen för att hålla den på plats. Spola äggledaren med ~ 0,1 ml av M16-medium för att frigöra de två-PN-embryon i en petriskål.
- Återställa 2-PN embryon tillsammans med omgivande cumulus massor från spolas M16 medium under stereomikroskop med en steril glaspipett och överföra dem till en ny petriskål.
- Dissociera cumulus-celler från de 2-PN-embryon genom enzymatisk digerering med 1,0 ml av 0,1 till 0,5% hyaluronidas i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) vid 37 ° C under 5-10 min.
- Beröva embryon genom att försiktigt pipettera med en glaspipett och avlägsnas fysiskt cumulus celler.
- Tvätta avklädda embryon tre gånger med 30-50 ml färsk fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per embryo.
- Inkubera embryon i en 35 mm plastpetriskål i M16-medium kompletterat med 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA, Fraction V) vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad inkubator tills mikroinjektion görs, som vanligtvis är mindre än 4 h senare.
3. Embryo Omvänd transkription (RT) och polymeraskedjereaktion (PCR)
- Samla minst 10 embryon från varje stadium upp till blastocyststadiet och förena dem i 4,0 | il 5x omvänt transkriptas pre-blandningslösning innehållande omvänt transkriptas, RNas-inhibitor, oligo dT-primer, slumpmässiga 6mers, dNTP blandning och reaktionsbuffert i en PCR-rör.
- Lägg RNas-fri destillerat H2O till en total volym av 20 | il och sonikera de poolade embryon för 30 sek vid 200 W. Initiera RT-reaktionen omedelbart vid 42 ° C under 1 h följt av 5 min inkubation vid 95 ° C.
- För varje 5,0 pl cDNA lösning genereras genomföra normal PCR-amplifiering med primers för neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, NANOG, Oct3 / 4, eller β-aktin (primersekvenser ges i tabell 1. PCR består av 40 cykler av 15 sek inkubation vid 95 ° C, 30 sekunder vid hybridiseringstemperaturen (visad i tabell 1), och 30 sek vid 72 ° C.
- Separata PCR-produkter genom elektrofores på en 2% agarosgel och visualisera gelén under UV-ljus efter färgning med etidiumbromid.
- Normalisera målgenuttryck mot p-aktin nivåer.
4. Immuncytokemi av embryon
- Fix embryon från varje steg med 4% paraformaldehyd i PBS under 30 min vid rumstemperatur följt av en kort tvättning 3 gånger med PBS innehållande 0,01% BSA.
- Permeabilisera Cellmembran genom att inkubera 10 embryon i 1,0 ml PBS innehållande 0,1% Tween 20 och 0,1% TritonX-100 vid rumstemperatur under 10 min.
- För att blockera icke-specifik bindning inkubera de permeabiliserade embryon i 1,0 ml PBS kompletterad med 10% normalt getserum under 30 min vid rumstemperatur.
- Inkubera blockerade embryon with kanin-anti-neogenin antikroppar vid 1: 100 utspädning i PBS innehållande 0,1% BSA över natten vid 4 ° C.
- Efter tre tvättningar för 30 sekunder vardera i droppar av PBS, inkubera embryon med antingen Alexa 488-konjugerad get-anti-kanin-IgG eller Alexa 568-konjugerad get-anti-kanin-IgG vid 1: 500 spädning i PBS / BSA-lösning över natten vid 4 ° C .
- Att visualisera aktinfilament, inkubera embryon i 1 | ig / ml phalloidin i PBS under 1 h vid rumstemperatur.
- Färga kärnorna genom att tillsätta 5 ml PBS innehållande 1 | ig / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid) under 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta embryon tre gånger hastigt med PBS.
- Överför embryon till en glasskiva och täcka dem med en droppe mineralolja.
- Ta bilder på 1,000X förstoring med en konfokalmikroskop med en excitering av lämplig våglängd.
5. Framställning av Neogenin-RFP och Neogenin-siRNA GFP plasmider
- Subklona cDNA som kodar för mus neogenin i en röd fluorescerande protein (RFP) innehållande vektorn, vilket resulterar i neogenin-flag-RFP.
- Subklona shrna targeting neogenin in i en Emerald grönt fluorescerande protein (EmGFP) -innehållande vektor, vilket resulterar i pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (visad i figur 1).
- Förstärka både neogenin-flagga-RFP och pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin plasmider och rena dem med konventionella metoder.
- Justera de slutliga koncentrationerna av plasmider till ~ 1,0 | ig / ml i steril Tris-EDTA (TE) buffert.
6. mikroinjektion av plasmider i två-PN Embryon
- Tvätta avklädda 2-PN embryon en gång i korthet, med färska M16 media.
- Centrifugera 2-PN embryon för 10 min vid 1000 x g i en bordscentrifug för att möjliggöra observation av prokärnorna.
- Inkubera embryona i en mikrodroppe av 20-30 | j, l av M16 media per embryo enligt mineralolja vid 37 ° C i 5% CO2 under en additional 1-2 tim.
- Tillverkning injektion pipetter och hålla pipetter genom att dra borosilikat glas kapillärrör (OD = 1,2 mm, ID = 0,94 mm) med en mekanisk avdragare.
- Tillverka injektion pipetter att ha trubbiga tips och polerade öppningar <500 um spets längd och 1-2 um spets innerdiameter med hjälp av en microgrinder och en microforger.
- Fabricera håller pipetter så att de har trubbiga tips och polerade öppningar med en innerdiameter av 20 ^ m och en ytterdiameter på 100 ^ m.
- Belastning injektionspipetter med en tillräcklig mängd (> 200 nl) av plasmid-lösning vid 1,0 mikrogram / l.
- Mikroinjicera ~ 10 pl av plasmid-lösning för varje 2-PN embryot i en av de prokärnorna med användning av en mikroinjektor fäst vid en motordriven mikromanipulator; under denna process, hålla embryon i läge genom att applicera negativt tryck med ett innehav pipett.
- Efter mikroinjektion, tvätta 2-PN embryon 3 gånger med färsk M16 media för less än 1 min varje gång.
- Kultur 2-PN embryon i en droppe av färsk M16 media på en plastodlingsskål täckt av en mineralolja droppe för att förhindra media avdunstning.
- Beakta embryon vid 24 timmars intervall enligt en differential interferens kontrast (DIC) inverterat mikroskop vid 200 gångers förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi upptäckte att neogenin är övergående uttryck under de tidiga utvecklingsstadier av embryon preimplantatorisk mus, uppträder så tidigt som vid två-cellstadiet och varaktig fram till början av morula men blir bristfällig på den sena morula och blastocyst stadier (Figur 2A). Dessutom har den geografiska fördelningen av neogenin begränsas främst utanför celler. Resultaten av RT-PCR-analys överensstämde med den tidiga och övergående karaktär neogenin uttryck, med en topp vid 4-cellstadiet men saknas helt vid 16-cellstadiet eller senare (Figur 2B). Däremot gjorde F-aktin inte att avslöja en sådan övergående och polariserat uttrycksmönster.
Vi undersökte därefter huruvida neogenin nivåer kan manipuleras genom mikroinjektion av antingen neogenin cDNA vektorer (neogenin gain) eller vektorer som härbärgerar shRNA inriktning neogenin (neogenin loss) in i den två-PN zygot. Att visuellt skilja neogenin vinst från neogenin förlust, RFP och GFP samuttrycktes som indikatorer (Figur 3), och den resulterande neogenin uttrycksnivån bekräftades både genom immunofluorescens och genom immunoblotting (Figur 4).
Figur 5 visar representativa bilder av embryon vid varje steg efter att ha fått antingen neogenin shRNA eller neogenin cDNA vid två-PN skede. Det fanns inga uppenbara brutto morfologiska skillnader mellan neogenin förlust och neogenin förstärknings embryon, och ingen utvecklingspotential skillnader åtminstone tills blastocyststadiet (tabell 2). Faktum är att både antalet överlevande embryon vid varje steg och antalet gripna embryon var inte signifikant olika.
Men ICM utvecklingen var mindre uttalad i neogenin förlust än neogenin embryon förstärknings somframgår av en högre uttryck av ICM-specifik Oct3 / 4 i neogenin förstärknings embryon (figur 6A) och högre antal Oct3 / 4-positiva ICM celler per blastocyst i neogenin vinst än neogenin embryon förlust (Figur 6B). Dessutom avslöjade RT-PCR-analys en stark korrelation mellan uttrycksnivån för tre transkriptionsfaktorer och av neogenin. I neogenin förlust blastocyster, lilla Oct3 / 4, var Sox2, och NANOG detekteras, vilket står i skarp kontrast till en signifikant ökning i uttrycket av alla tre transkriptionsfaktorer i neogenin förstärkning över kontrollembryon (Figur 6C). Oväntat, de uttrycksnivåer av Cdx2 och Tead4, transkriptionsfaktorer implicerade i TE differentiering / underhåll 6,7, påverkades mindre av uttrycksnivån för neogenin, validera att uppreglering av neogenin leder till aktivering av transkriptionsregulatorer som är specifika för ICM men inte för TE etablering. Alla data som visas är m odified från referens 9.
Figur 1: Strukturen i pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Uttryck av Neogenin Under Mouse embryonala utveckling (A) Confocal mikroskopiska bilder av neogenin uttryck i preimplantatorisk embryon vid olika utvecklingsstadier. (B) Den RT-PCR av neogenin mRNA i preimplantation embryon vid olika utvecklingsstadier. β-aktin användes som en intern kontroll.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Grönt fluorescerande protein (GFP) och Red fluorescerande protein (RFP) Expression som indikatorer för Neogenin Förlust och Neogenin Gain, respektive efter mikroinjektion av en neogenin inriktning shRNA vektor som härbärgerar konjugerad GFP eller mikroinjektion av en neogenin cDNA vektor som härbärgerar RFP i 2-PN zygoter, uttrycket av GFP och RFP visualiserades under ett fluorescensmikroskop vid två-cell- och 4-cellstadier. Vänstra panelen, fas-kontrastrika bilder; mellersta och högra panelerna, fluorescensbilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Uttryck av Neogenin i en blastocyst Efter Mikroinjektion av antingen shRNA Targeting Neogenin eller Neogenin cDNA (A) Efter mikroinjektion av en neogenin-targeting shRNA vektorn i två-PN-zygoter, var expressionsnivån av neogenin i enskilda blastocyst-celler utvärderades genom immunfärgning med anti-fLAG-antikroppar. I den vänstra panelen, oordning neogenin shRNA vektorer injiceras (kontroll). I den högra panelen, var neogenin inriktning shRNA vektorer injiceras. DAPI, DAPI (blå) användes för att färga kärnan; Anti-Flag, visualisering av flagg tag på neogenin (röd); GFP, grönt fluorescerande protein (green); samman, överlagring av DAPI, anti-flagga, och GFP. (B) Hela cellysat av blastocyster immun med anti-FLAG-antikroppar. GFP användes som en laddningskontroll. Scrambled shRNA, scrambled neogenin shRNA injektion; Ng shRNA, neogenin inriktning shRNA injec tion. (C) De neogenin cDNA vektorer eller de neogenin-targeting shRNA vektorer mikroinjicerades in i de två-PN-zygoter och de resulterande blastocyster underkastades immunfärgning med anti-neogenin antikroppar för att mäta neogenin expressionsnivå. I den övre panelen, var neogenin inriktning shRNA injiceras. Blastocyster immun med anti-neogenin antikroppar (röd). GFP, grönt fluorescerande protein (green); Sammanslagen, lagring av DAPI, anti-neogenin och GFP. I den nedre panelen, var neogenin cDNA vektorer injiceras. Blastocyster immunfärgades med anti-neogenin antikroppar (grön). DAPI, DAPI nukleär färgning (blå); RFP, rött fluorescerande protein (röd); Sammanslagen, lagring av DAPI, RFP, och anti-neogenin. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
pload / 53.696 / 53696fig5.jpg "/>
Figur 5: Effekter av Neogenin förlust eller vinst på embryots utveckling. 2-PN musembryon mikroinjicerades antingen med shrna (shRNA) inriktning neogenin (neogenin förlust) eller med vektorer som härbärgerar neogenin cDNA (neogenin vinst) och odlades tills de når blastocyststadiet. Att skilja neogenin förlust från neogenin förstärknings embryon, GFP och RFP samuttrycktes respektive. Faskontrast bilder av embryon vid olika utvecklingsstadier visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Neogenin Uttryck Favors ICM Differentiation (A) ICM-celler i blastocyster betraktades genom immunfärgning för Oct3 / 4.. DAPI användes för att stai kärnan. (B) Antalet Oct3 / 4-positiv ICM-celler i en blastocyst av kontroll, neogenin förlust och neogenin förstärknings embryon representeras som medelvärde ± SEM från tre oberoende experiment med minst 10 embryon som används i varje experiment. * Signifikanta skillnader från kontroll vid p <0,05 vid Students t-test. (C) RT-PCR-analys av Oct3 / 4, Sox2, NANOG, Cdx2 och Tead4 mRNA från blastocyster av neogenin förlust, neogenin vinst och embryon kontroll. β-aktin användes som en intern kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sekvenser av de primers och PCR-betingelser som användes för RT-PCR.
Tabell 2: Antalet överlevande musembryon vid varje utvecklingsfas Efter att ha fått Neogenin shRNA eller Neogenin cDNA vid två-PN scenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuvarande protokollet visar vi nya metoder för mikroinjektion av genetiskt material, antingen cDNA eller shRNA, i embryona 2-PN musen för att utforska den roll neogenin i början av celldifferentiering under mus embryogenes. Genetisk modifiering av preimplantatorisk embryon är en kraftfull teknik i att avslöja viktig information om bakomliggande molekylära mekanismer för, till exempel, den första cellen härstamning bestämningen. Genmodifiering är en av de vanligaste metoderna för att fastställa genfunktion. Med relativt stor receptibility av de två-PN embryon för utländska genetiska material och möjligheten att mikroinjektion av cDNA och shRNA i 2-PN embryon kan detta embryo manipulation teknik implementeras med minimal fysisk störning av embryot, för att inte nämna den inneboende komplementaritet i samband med denna genetisk manipulation.
Med tanke på att cytoplasma injektion är enklare och mindre skadligatill överlevnad än nukleär injektion, men ändå är en högre uttryck av främmande DNA i samband med nukleär injektion, en förbättring som bör understrykas att använda centrifugering för att positionera pronuclei före mikroinjektion in i kärnan. Den mest tekniskt avancerade och krävande steget är mikroinjektion av främmande DNA i prokärnan av ett befruktat ägg. Detta steg är kritisk och kräver betydande teknisk kompetens och omfattande utbildning för att behärska mikroinjektion förfarande. När denna färdighet är dock förvärvas, teknisk variation och fel blir minimal. Rutinen överlevnad mikroinjicerade embryon är mellan 80-90% i vår anläggning.
Till skillnad från denna studie, andra forskare placerade embryon genom att hålla pipetten så att en pronukleus nära plasmamembranet var nära mikronålen. Mikronålen införs sedan i den prokärnan 10,11. Vi upplevde vissa svårigheter att visualisera prokärna korrekt under mikroskop utan centrifugering. Uppenbarligen ger centrifugering kärnan nära plasmamembranet för bättre identifiering. Samtidigt bör det finnas ett visst utrymme för förbättringar för bättre visualisering därmed bättre placering av pronukleus.
I motsats till transgena möss produktion, är våra protokoll för mikroinjektion av plasmider till embryon övergående transfektion av naturen, och därmed lämplig för dissekera geners funktion under preimplantatorisk embryonal utveckling. Därför kan våra protokoll för en förlust- och vinna-of-funktion teknik generaliseras ytterligare för att identifiera signalmolekyler som är involverade i tidig embryonal utveckling.
Dessutom skulle neogenin signalerings vara mycket fördelaktigt för utvecklingen av embryonala stamcellslinjer med tanke på att neogenin och dess ligander kommer sannolikt att förbättra stamcells specifika transkriptionsfaktorer såsom Oct3 / 4, Sox2, och Nanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill också tacka för Dr Xiong grupp vid Georgia Health Sciences University för att tillverka och dela konstruktioner för neogenin cDNA och shRNA vektorer. Denna studie har finansierats med bidrag från grund Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) finansieras av den koreanska Research Foundation och ett forskningsanslag från Sahmyook University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
