Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Abstract

La prolifération rapide des cellules, l'expression tissu-spécifique des gènes et de l'émergence de réseaux de signalisation caractérisent le développement embryonnaire précoce de tous les vertébrés. La cinétique et l'emplacement des signaux - même à l'intérieur des cellules individuelles - dans l'embryon en développement complète l'identification des gènes du développement importants. immunocoloration techniques sont décrites qui ont été montré pour définir les cinétiques de signaux intracellulaires et des animaux entiers dans des structures aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation, d'imagerie et de traitement des images en utilisant un laser à balayage composé microscope confocal peut être complété en aussi peu que 36 heures.

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme souhaitable pour les enquêteurs qui cherchent à mener des études dans une espèce de vertébré qui est abordable et pertinente à la maladie humaine. KO ou passes rabattues génétiques doivent être confirmées par la perte du produit protéique réelle. Cette confirmation de la perte de protéinespeut être réalisée en utilisant les techniques décrites ici. Des indices dans les voies de signalisation peuvent également être déchiffrés en utilisant des anticorps qui sont réactifs avec des protéines qui ont été modifiées après la traduction par phosphorylation. La préservation et l'optimisation de l'état phosphorylée d'un épitope est donc essentiel de cette détermination et est accompli par ce protocole.

Cette étude décrit les techniques pour fixer des embryons au cours des premières 72 heures de développement et de co-localiser une variété d'épitopes pertinents avec cils dans des vésicules (KV) de l'Kupffer, le rein et l'oreille interne. Ces techniques sont simples, ne nécessitent pas de dissection et peut être complété en une période relativement courte de temps. Projection des piles d'images confocale en une seule image est un moyen utile de présenter ces données.

Protocol

Les procédures de poisson zèbre dans ce protocole ont été approuvés par la Commission institutionnelle animal soin et l'utilisation (IACUC) à l'Université Virginia Commonwealth.

1. Préparation des réactifs

  1. 4% PFA / PBS. Peser 8 g de paraformaldehyde (PFA) dans la hotte. Alors qu'il était encore dans la hotte, dissoudre le PFA sec ~ 80 ml ​​de H 2 O distillée sous agitation et chauffage à 50 ° C. Tout en remuant, ajouter 3 - 10 gouttes de 1N NaOH frais jusqu'à ce que PFA est complètement dissous et une solution précise. Retirer du feu et ajouter 100 ml 2x tampon phosphate salin (PBS). Porter le volume à 200 ml d'eau distillée H 2 O. Refroidir à température ambiante et de confirmer pH de 7,4 avant utilisation. A conserver dans l'obscurité à 4 ° C, mais utiliser dans la semaine.
  2. Utiliser 100% de méthanol sans suppléments. Utiliser 95% d'éthanol sans suppléments.
  3. Préparer tamponnée au phosphate Tween (PBT). Compléter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de Tween-20. Ajouter 0.5 ml d'une Tween-20 solution stock de 20% à 100 ml de PBS 1X. Stocker à température ambiante.
  4. Préparer tamponnée au phosphate Triton-X (PbTx). Supplément PBS avec 0,1% de Triton X-100. Ajouter 0,5 ml d'un 20% de Triton X-100 actions pour 100 ml de PBS. Stocker à température ambiante.
  5. Préparer 10% NGS / PbTx. Normales blocs de sérum de chèvre (NGS) sites de liaison non spécifiques. NGS Stocker à -20 ° C. Pour l'utiliser, ajouter 1 ml à 9 ml PbTx.
  6. Préparer glycerol à 50% / PBS. Mélanger des parties égales de fond 2x PBS et 100% de glycérol. Stocker à température ambiante.

2. Fixation Embryo

  1. . (. Par exemple, β-actine: CAAX-GFP) Elevage Obtenir de type sauvage (AB et WIK) ou transgéniques embryons par des accouplements naturels. Si vous le souhaitez, d'injecter des embryons avec des constructions ou morpholinos, comme décrit. 15,16
  2. Lever embryons. Recueillir les embryons et incuber à 28,5 ° C en présence de 0,003% 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour bloquer la pigmentation tel que décrit. 17 p>
  3. Fix. Lorsque les embryons ont atteint le stade de développement souhaité, 18,   anesthésier les embryons en utilisant MESAB, éliminer l'eau du système autant que possible et d'ajouter frais 4% PFA / PBS pendant 3-4 heures à température ambiante. NOTE: À certains moments de moins de 20 heures après la fécondation (HPF), fixer avant dechorionation. Parfois, après 20 HPF, dechorionate avant la fixation à l'aide de deux paires de pince fine point sous un microscope de dissection.
  4. Modification de solutions. Transfert d'embryons en utilisant une pipette de grand calibre, comme décrit. 17 Changer les solutions dans 1,5 ml plafonnés microtubes, simplement en permettant aux embryons de régler par gravité, sans centrifugation.
  5. Post-fixateur Après 3 -. 4 heures, retirer PFA / PBS, remplacer par 100% de méthanol et conserver à -20 ° C pendant au moins 48 heures. NOTE: Pour maximal immunoréactivité P-CaMK-II, limiter la durée totale de stockage de méthanol pour une semaine.
"> 3. Immunocoloration Whole embryons

  1. Placez un minimum de 10 embryons pour chaque condition expérimentale en coiffé tube de 1,5 ml, et de les étiqueter.
  2. Autoriser les embryons de se déposer. Enlever et jeter le methanol et réhydrater avec des lavages progressifs contenant 0,5 ml de concentrations décroissantes d'éthanol, comme indiqué dans l'étape suivante. Chaque étape est un lavage de 5 min à bascule.
  3. Progressivement réhydrater avec ces 5 solutions: 66% éthanol / 33% PbTx, 33% éthanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (ce qui est la première répétition de PbTx), 100% PbTx (ce qui est la seconde répétition de PbTx).
  4. Retirer dernier lavage PbTx. Ajouter 0,5 ml 10% NGS / PbTx. Incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante avec doux balancement puis enlever et jeter la solution.
  5. Préparer une solution d'anticorps primaire par dilution dans 10% de NGS / PbTx. Si co-immunologique, utilisez anticorps d'affinité plus élevée en premier. Pour cette étude, l'incubation avec l'anticorps monoclonal de la tubuline de souris anti-acétyle dilué à 1: 500. pour example, s'il y a des 10 échantillons, le regroupement de 6 pi de la solution d'anticorps boursier avec 3 ml de 10% NGS / PbTx puis distribuer 0,3 ml de ce dans chaque tube.
  6. Ajouter 0,2 - 0,5 ml de l'anticorps primaire dilué dans chaque tube pour immerger les embryons. Incuber avec doux balancement O / N à température ambiante.
  7. Dans la matinée, enlever et jeter la solution d'anticorps. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx pour laver anticorps primaire excès. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  8. Dim plafonniers et diluer l'anticorps secondaire fluorescent conjugué appropriée dans 10% NGS / PbTx sorte que chaque état contient au moins 0,5 ml. Avec l'anticorps primaire tubuline souris anti-acétyle, utilisez la chèvre de colorant vert fluorescent IgG anti-souris à une dilution de 1: 500.
  9. Incuber anticorps secondaire pendant 4 heures avec doux balancement à la température ambiante dans l'obscurité. A partir de maintenant, traiter les échantillons sous les lumières tamisées et incuber dans un récipient sombre ou en l'enveloppant dans du papier aluminium.
  10. A la fin de l'incubation, retirer et jeter la solution d'anticorps secondaire. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx à laver. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  11. Si co-immunologique, obtenir la deuxième anticorps primaire d'une espèce différente que le premier anticorps primaire. Dans ces études, suivre l'anticorps de lapin anti-phospho CaMK-II par le colorant conjugué anticorps de chèvre anti-lapin anticorps secondaire fluorescent rouge-IgG.
  12. Diluer de lapin anti-phospho-CaMK II anticorps 1:20. Pour chaque tube d'embryons, de suspendre dans 0,3 ml 10% NGS / PbTx, puis ajouter 15 pi de la solution d'anticorps de stock.
  13. Veiller à ce que les embryons sont immergés et lumières sont tamisées. Incuber avec douceur O bascule / N à la température ambiante dans l'obscurité.
  14. Dans la matinée, sous les lumières tamisées, enlever et jeter la solution d'anticorps. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  15. Gardez plafonniers sombre et assez de la fluorescence Conju appropriée diluerun anticorps secondaire fermée de sorte que chaque état contient au moins 0,5 ml. Dans cette étude, on dilue le colorant conjugué de chèvre anti-anticorps de lapin IgG rouge fluorescent secondaire (canal rouge) 1: 500 dans 10% de NGS / PbTx.
  16. Incuber deuxième anticorps secondaire pendant 4 heures avec doux balancement à la température ambiante dans l'obscurité.
  17. A la fin de cette incubation et sous les lumières tamisées, enlever et jeter la solution d'anticorps secondaire. Ajouter 0,5 ml PbTx. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois. Magasin à PbTx ou soit 50% de glycérol / PBS en fonction de la procédure d'imagerie.

4. imagerie confocale et traitement

  1. Mont embryons pour l'imagerie. Placez 1 - 5 embryons sur une lame de verre. Créer une chambre entre la lamelle et la lame principale en utilisant des fragments de lamelle de chaque côté de la chambre. Typiquement, quatre n ° 1 des lamelles sont utilisés pour fabriquer ces espacement des piles sans étanchéité.
    NOTE: Aucune milieu de montage est nécessaire.
  2. Utiliser une immersion dans l'huile 100Xobjectif d'apporter seul embryon au point en utilisant la lumière transmise. Éteins la lumière. Allumez microscope confocal. Veiller à ce que les lasers appropriés (vert et / ou rouge) sont allumés et à distance accent complice est engagé.
  3. Allumez le programme confocal. Dans la "barre de Acquire", sélectionnez l'objet propre. Dans la barre "XY de base", définir la taille de l'image à 1024 en cliquant sur le bouton 1024.
  4. Dans le "Laser et Detector" bar, cliquez sur la case 488 rouge et le 568 boîte verte pour activer le laser et le détecteur pour chaque canal. Set sténopé à moyen et à régler le gain dans la barre "Gain" de chaque canal à visualiser.
  5. Dans la barre «acquérir Paramètres", cliquez sur "Live" pour commencer l'acquisition d'images. Dans la barre "Paramètres d'affichage", décochez la case "force intégrale Zoom" du centre dans la fenêtre "Live".
  6. Dans la barre "Acquérir Paramètres", sous l'onglet "Z", l'étape à travers les couches de l'image. Après avoir sélectionné le numbre de sections optiques à intégrer dans l'image, passer à un certain moment dans le «centre» du plan z.
  7. Sous l'onglet "Z", cliquez sur la petite boîte rouge "de référence". Ce sera zéro la RFA au point choisi comme le «centre». Dans la case "Taille de l'étape", sélectionnez l'épaisseur des couches (entre 0,25 um et 2,0 um est idéal). Faites attention à la case «Taille du fichier» et essayer de limiter à 1 Go.
    NOTE: En général, jusqu'à 40 sections optiques de 0,5 à 1,0 um sont obtenues, mais le nombre de sections peut être déterminé de manière empirique.
  8. Pour trouver l'extrême haut de l'image, cliquez sur le cercle à côté de "Top" et se déplacer à travers les couches z. Maintenant, cliquez sur le cercle à côté de "Bas", l'ordinateur prendra l'image sur la couche en tant que centre. se déplacer à nouveau à travers les couches de trouver l'extrême bas de l'image.
  9. Cliquez sur "Live" à nouveau dans les «acquérir Paramètres" boîte pour arrêter le laseracquisition. Dans ce panneau, cliquez sur les cases rouges marqués moyenne et Z-stack. Ces boîtes devient vert.
  10. Dans la zone «acquérir Paramètres", cliquez sur "Single" d'acquérir la totalité des séries d'images. Vous pouvez suivre les progrès qui scrute dans les deux canaux et à travers toute la z-stack.
  11. Pour enregistrer, cliquez sur la fenêtre du volume et cliquez sur "enregistrer sous" et nommez le fichier. Enregistrer comme ".ids" fichier. Au volume rendre le fichier alors que le z-stack est toujours ouverte, sélectionnez les données menu déroulant et cliquez sur «volume render". Enregistrez le fichier rendu sous forme de fichier TIFF. Ceci est l'image projetée qui sont présentées dans cette publication.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Conditions optimales pour la visualisation de phospho-épitopes

Des procédés décrivant l'immunolocalisation des epitopes protéiques dans embryons de poisson zèbre ont été relativement peu par rapport à celles de localisation d'ARNm par hybridation in situ. Fixateurs utilisés dans la localisation des épitopes des protéines dans les cellules ciliées des embryons de poisson zèbre ont inclus 4% PFA / PBS et le fixateur de Dent, qui est un mélange de méthanol et de DMSO. 19 Localisation de l'ARN par le mont toute hybridation in situ (WISH) est généralement réalisé en utilisant PFA suivie par le stockage dans 100% de méthanol. 20,21 Nos études ont révélé que la combinaison WISH de fixateur, lorsque limitant le temps dans le méthanol à entre deux et sept jours, a été largement supérieure à tout autre fixatif pour immunolocalisation avec l'anticorps P-CaMK-II . Le signal obtenu avec cette / combinaison de méthanol PFA était also nettement plus grande que lorsque le fixateur, 4% PFA / PBS ou de methanol Dent ont été utilisés seuls, en fonction du temps de développement et de l'emplacement au sein de l'embryon.

Lors de l'optimisation de la technique décrite ici et à chaque fois que le fixateur et le développement utilisée, un échantillon témoin a été préparé, dans lequel toutes les étapes ont été suivis, excepté que l'anticorps primaire a été omis. Ces échantillons de contrôle ont manqué d'un signal fluorescent lorsqu'il est imagé dans les mêmes conditions décrites ci-dessus. Ce contrôle est recommandé pour les autres chercheurs répliquant cette approche avec tout anticorps.

La combinaison / méthanol de fixateur PFA a donné le signal P-CaMK-II plus fort et était également compatible avec un marquage pour la tubuline acétylée, qui est un marqueur standard pour les cils. De développement, le premier organe cilié qui se dégage et qui a été imagé dans ces études est la vésicule du Kupffer (KV). Le KV est situé à l'extrémité postérieure de la notocorde comme indiqué au stade 12 somites (15 HPF) (Figure 1). Le KV est un organe transitoire et est responsable de l'asymétrie gauche-droite. Il ressort à l'étape 2 somites (12 HPF) et disparaît autour de la scène de 18 somites. Battre les cils primaires générer un écoulement circulaire du fluide, ce qui conduit à une élévation de Ca2 + dans les cellules ciliées qui tapissent le KV et l'activation des CaMK-II dans des endroits discrets (Figure 1). P-CaMK-II réactivité apparaît et disparaît sur ​​un côté de la KV tant que cils battent. 12 À ce stade précoce, les niveaux totaux embryonnaires CaMK-II ne sont encore que la moitié du niveau au 24 HPF et un dixième du niveau à 3 jours de développement. 11 Peut-être parce que l'expression totale CaMK-II est relativement faible à 15 HPF, toute amélioration de la technique d'immunocoloration à ce stade est particulièrement important.

between 24 et 72 HPF du développement, P-CaMK-II apparaît sur ​​la surface apicale des cellules ciliées qui tapissent des régions spécifiques des conduits pronephrique (figures 2,3). L'immunoréactivité du total CaMK-II sur toute la conduit pronephrique et tout au long somites adjacents (Figure 2) montre que seul un sous-ensemble de l'embryon CaMK-II est activé (P-CaMK-II).

Fixation conditions soient compatibles avec la préservation de la fluorescence de GFP

Ces techniques de fixation sont également compatibles avec conservant la protéine fluorescente verte (GFP) fluorescence sans amélioration (Figure 3). Dans le CaMK-II de la GFP-étiqueté construction qui est utilisée dans cette figure, la GFP conserve fluorescence suffisante si PFA / fixation au méthanol et coloration immunologique ultérieure. Dans une vue à fort grossissement des cellules qui tapissent le conduit pronephrique (Figure 3), ee expression mosaïque de GFP-CaMK-II peut être vu dans les cellules qui ont également été immunocolorées P-CaMK-II.

L'oreille embryonnaire du poisson zèbre est un autre tissu dans lequel l'élévation de Ca 2+, agissant par l'intermédiaire CaMK-II, influe sur son développement. 14 oreilles de poisson zèbre apparaissent normalement à environ une journée de développement. A ce moment, CaMK-II est intensément active à la base des kinocilia et à des niveaux plus faibles le long de la kinétocil (Figure 4). Cette série d'images montre que cette technique de fixation et de coloration immunolocalisation peut détecter les franges à l'intérieur, une structure dont la section transversale est inférieure à 1 um. Ces cils conservent leur structure tout au long de ce processus de fixation et immunologique.

Un exemple supplémentaire de contre-coloration à deux couleurs dans l'oreille interne à un moment ultérieur de développement a été réalisée par coloration à la fois avec Alexa 488phalloïdine et anti-tubuline acétylée suivie d'une Alexa 568 étiquetés anticorps secondaire (figure 5). Il est à noter que la méthode / méthanol de fixation PFA préserve à la fois la F-actine et la tubuline, ce qui est pas le cas de tous les fixateurs. Cet exemple est présenté comme une image en couleurs pour l'ensemble fusionné oreille et ensuite pour 14 sous-régions.

Un exemple représentatif de la dernière contre-coloration à deux couleurs a été effectuée avec une souche de poisson qui a produit des embryons avec GFP à la membrane cible (Figure 6). Membrane GFP ciblée est pas attaché à une autre protéine et est perdu lorsque l'extrait avec du methanol, par conséquent, cette image a été obtenue à partir de poissons qui ont été fixés avec PFA seul. Ce résultat suggère que le traitement de méthanol extrait des membranes, de sorte qu'il ne soit pas recommandé pour des protéines qui peuvent être exclusivement liée à la membrane. Le signal P-CaMK-II sur cette figure est diminuée par rapport à celle obtenue si méthaneol ont également été utilisés, mais cela démontre que, à ce stade et la localisation (rein) de l'embryon en développement, le signal est suffisamment fort pour être détecté sans traitement de méthanol. Cela ne veut pas vrai à l'étape de KV;.-À-dire, le méthanol est nécessaire pour visualiser P-CaMK-II immunocoloration. Cet exemple est seulement représenté par une image fusionnée où conduit pronephrique du rein est adjacente au tronc muscle.

En résumé, le procédé de fixation / méthanol PFA décrite ici est compatible avec le maintien de la GFP et de coloration pour la F-actine, tubuline acétylée, le total des CaMK-II et P-CaMK-II.

Figure 1
Figure 1. P-CaMK-II contre-coloration pour acétylé tubuline (cils) dans KV poisson zèbre. Vues d'une seule étape de 12 somites en direct (12 ss) embryon révèle l'emplacement postérieur du KV par l'arrowhead (vue latérale, A) et le cercle intérieur de la boîte (vue ventrale, B). Embryons à ce stade ont été résolus à l'aide PFA / méthanol. Les embryons ont été immunocoloration pour la tubuline acétylée suivi d'un 488 anticorps secondaire marqué au Alexa (canal vert). Ensuite, l'anticorps polyclonal de lapin contre la P-CaMK-II a été suivi par un anticorps secondaire marqué 568- Alexa (canal rouge). Deux canaux projections d'images fluorescentes ont été acquis comme décrit à des grossissements plus en plus élevés (C, D). Barre d'échelle = 10 um. Ce chiffre est modifié à partir d'une publication antérieure. 12 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. P-CaMK-II contre-coloration pourTotal CaMK-II le long rein poisson zèbre. Un embryon dechorionated unique à 30 HPF a été fixé à l'aide PFA / méthanol. Les embryons ont ensuite été colorées pour un total CaMK-II suivie par l'anticorps Alexa 488 secondaire marqué (vert). Ensuite, l'anticorps primaire P-CaMK-II a été suivi par l'anticorps secondaire Alexa 568 marqué (rouge). Coloration révèle un enrichissement activé CaMK-II (en rouge) le long de la surface apicale des cellules qui tapissent les canaux du rein poisson zèbre pronephrique tandis totale CaMK-II est enrichi au niveau des limites de somites de tissu musculaire adjacent et dans sarcomères. Barre d'échelle = 50 pm. Ces images ont été acquises à un grossissement inférieur à celui décrit dans le texte afin de visualiser l'ensemble du rein. Ce chiffre est modifié à partir d'une publication antérieure. 13 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3. P-CaMK-II contre Imaged pour la GFP dans les cellules rénales de poisson-zèbre. Cet embryon de 30 HPF a été injecté avec un ADNc codant pour une dominants négatifs GFP-CaMK-II. 13 Ces injections montrent généralement l'expression mosaïque. L'embryon a été fixé à l'aide PFA / méthanol, puis immunocolorée P-CaMK-II en utilisant un anticorps secondaire marqué Alexa 568. Imagerie révèle que GFP persiste à travers PFA / méthanol fixation, réhydratation, de blocage et immunologique. Barre d'échelle = 10 um. Ce chiffre est modifié à partir d'une publication antérieure. 13 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 P-CaMK-II de contraste avec acétylé tubuline à Ear poisson zèbre intérieure. Cet embryon de 30 HPF a été fixé à l'aide PFA / méthanol. L'anticorps anti-tubuline acétylée a été suivie dans l'ordre par l'anticorps Alexa 488 marqué au secondaire, l'anticorps P-CaMK-II et l'anticorps secondaire marqué Alexa 568. Coloration révèle que P-CaMK-II est présent le long des cils de l'oreille interne et co-localise avec la tubuline acétylée. Barre d'échelle = 5 um. Ce chiffre est modifié à partir d'une publication antérieure. 14 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Actine et tubuline acétylée à Ear poisson zèbre intérieure. Un enfant de trois jour (72 HPF) embryon de poisson zèbre a été fixé et immunocolorée pour acétylé tubulin utilisant Alexa 568 anticorps secondaires marqués au, suivie par la visualisation de l'actine en utilisant Alexa 488 phalloïdine. Cilia ainsi que innervation axonale de l'oreille est révélée par la tubuline acétylée (en rouge) et les structures F-actine comprennent des fibres musculaires (en vert). Deux régions ciliées sensorielles de l'oreille poisson zèbre sont présentés plus en détail: la macula antérieure (h) et de crête postérieure (PC). Barre d'échelle = 10 um. Ce chiffre est modifié à partir d'une publication antérieure. 14 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
. Figure 6 P-CaMK-II contre Imaged pour Membrane GFP dans rein poisson zèbre Cette image fusionnée unique dans lequel la β-actine. CAAX-GFP embryon (30 HPF) a été fixé et coloré pour P-CaMK-II suivie par l'anticorps secondaire marqué Alexa 568. Coloration révèle un enrichissement activé CaMK-II (en rouge) le long de la surface apicale des cellules qui tapissent les canaux du rein pronephrique poisson zèbre. Ces cellules de rein canalaires sont nichés juste sous le tissu musculaire et les deux sont marquées par l'expression de la membrane cible GFP (en vert). Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode / méthanol PFA a été développé dans ce laboratoire avec l'objectif principal d'optimiser la immunolocalisation du -CaMK-II épitope phospho-T 287 au cours du développement du poisson zèbre. Cette méthode localisée succès P-CaMK-II lors de la formation de plusieurs organes ciliées dont le KV de poisson zèbre, 12 oreille interne 14 et les reins. 13 en particulier au stade de KV, cette technique était nécessaire. Le succès de cette méthode est probablement due à une combinaison de a) minimisation de l'autofluorescence, b) la conservation de l'épitope phospho-CaMK-II et c) une meilleure accessibilité de l'épitope d'anticorps.

Une première limite de cette approche est la période de stockage dans le méthanol. Bien que l'immunoréactivité de la P-CaMK-II est maximale au bout de deux jours dans du methanol à -20 ° C, la réactivité de cet epitope est perdue au bout d'une semaine de stockage dans le méthanol. On ne sait pas si à ce moment le groupe phosphate est hydrolyzed ou encore la dénaturation se produit qui diminue immunoréactivité. Méthanol / EGTA à -20 ° C est un fixateur traditionnellement rapide pour la conservation des structures de tubuline riche au cours du développement d'embryons précoces. 22 Cependant, le methanol seul est pas souhaitable de préserver la morphologie ou même des structures telles que le cytosquelette d'actine et doit être précédée d' PFA.

D'autres avantages de cette approche est qu'elle préserve également d'autres épitopes tels que F-actine et la tubuline acétylée et ne supprime pas la fluorescence naturelle de la GFP. D'autres fixateurs, tels que le fixateur de Dent, sont supérieurs à d'autres epitopes 13 et restent compatibles avec une coloration P-CaMK-II, bien que la coloration P-CaMK-II est plus faible dans le fixateur de Dent de PFA / méthanol. Depuis phospho-protéines sont répandues dans les voies qui sont actives au début du développement de signalisation, le fixateur de Dent et PFA / méthanol sont recommandés comme deux fixatifs pour d'autres phospho-épitopes dans zebembryons rafish. Dans le développement d'applications avec cette technique pour d'autres protéines et leurs anticorps, il a été utile d'avoir des anticorps qui sont également réactifs sur immunoblots et avoir cloné et protéines avec lesquelles les anticorps peuvent être validés surexprimé. 12

Il vaut la peine d'optimiser les techniques pour immunolocalisation parce qu'il a) peut vérifier la suppression du gène au niveau des protéines et b) permet le développement de modèles d'action. Dans ce laboratoire, les résultats de ces essais ont permis la formulation de modèles à travers lesquels les fonctions CaMK-II. Par exemple, son emplacement dans le KV est transitoire et asymétrique, comme le rôle de cet organe. Dans le rein, son emplacement sur le côté apical des cellules canalaires pronephrique suggère des rôles qui répondent à des signaux provenant du conduit. Enfin, l'activation de cette enzyme dans puncta intense spécifique à la base de kinocilia d'oreille suggère un signal Ca2 + localisée. Les procédés décrits icidevrait également être utile pour tout enquêteur qui cherche à obtenir des images à haute résolution de tout type de cellules embryonnaires dans deux canaux fluorescents.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation subvention IOS-0817658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

Chimie Numéro 108 Fixation phospho-épitopes le calcium les cils la microscopie la vésicule du rein de l'oreille le poisson zèbre de Kupffer
Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter