analizzare<em> In Vivo</em> Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
Negli organismi multicellulari, migrazione cellulare è essenziale sia per lo sviluppo dell'embrione in cui assicura l'organizzazione delle cellule in tessuti e organi, e per la vita adulta, dove partecipa alla omeostasi tissutale (cicatrizzazione) e l'immunità. Oltre a queste funzioni fisiologiche, la migrazione delle cellule è anche coinvolto in diverse situazioni patologiche, tra cui, in particolare, le metastasi del cancro.
La migrazione cellulare è stato analizzato in vitro per decenni, fornendo una comprensione generale dei meccanismi molecolari che assicurano movimenti delle cellule sulle superfici piane. In vivo Tuttavia, le cellule sono di fronte a un ambiente più complesso. È chiaramente apparso negli ultimi anni che la migrazione all'interno di un organismo può essere influenzata da stimoli esterni come la matrice extracellulare, cellule o chemochine secrete guida migrazione vicina, e che i meccanismi di guida migrazione cellulare può variare da quanto descritto <em> in vitro 1,2. I meccanismi che garantiscano nella migrazione cellulare vivo hanno ricevuto meno attenzione finora, principalmente a causa della maggiore difficoltà tecnica, rispetto a studi in vitro. Analisi in vivo della migrazione cellulare in particolare richiede l'accesso ottico diretto alle cellule migrano, tecniche per marcare le cellule uniche a per vedere la dinamica e la morfologia, così come guadagno o perdita di funzione approcci per testare il ruolo dei geni candidati. Finora, solo pochi sistemi modello che ospitano queste caratteristiche sono stati utilizzati per sezionare nella migrazione delle cellule in vivo 3.
Recentemente abbiamo usato la migrazione del piatto precordale prospettico nei primi embrioni di zebrafish come un nuovo sistema pratico modello per valutare la funzione dei geni candidati nel controllo nella migrazione delle cellule in vivo 4,5. Piastra precordale prospettico (noto anche come anteriore mesendoderm) è un gruppo di cellule che formano al momento della comparsa di Gastrulation sul lato dorsale dell'embrione. Durante la gastrulazione questo gruppo migra collettivamente verso il polo animale dell'embrione 6-8, per formare la lastra precordale, un ispessimento mesendodermal, anteriore alla notocorda, e alla base della piastra neurale. La parte anteriore della piastra precordale darà luogo alla ghiandola cova, mentre la sua parte posteriore probabilmente contribuisce a testa mesoderma 9. Grazie allo sviluppo esterna e chiarezza ottica dell'embrione pesci, migrazione cellulare può essere direttamente e facilmente osservata in questa struttura.
Il trapianto cellulare è una tecnica molto potente che consente la creazione rapida e semplice di embrioni mosaico 10. Esprimendo marcatori del citoscheletro fluorescenti in cellule trapiantate risultati nell'etichettatura delle cellule isolate, la morfologia e la dinamica delle quali possono essere facilmente osservati. Combinando questo per perdita o guadagno di funzione avvicina permette l'analisi delle funzioni cellulari autonomi di una lattinagene didati.
Il protocollo presentato descrive come abbiamo valutato la funzione della componente TORC2 sin1 nel controllo della dinamica di migrazione cellulare e di actina in vivo 5. Ma, come detto nei risultati e ulteriormente discussa, potrebbe essere utilizzata per analizzare il potenziale implicazione di un gene candidato nel controllare la migrazione delle cellule in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta un modo semplice per studiare il ruolo di un gene candidato nella migrazione delle cellule in vivo, unendo la creazione di embrioni chimerici con il trapianto di cellule con l'imaging dal vivo.
Creazione di embrioni a mosaico
Studiando le dinamiche di una cellula richiede la visualizzazione del suo contorno di analizzare estensioni citoplasmatiche. Ciò può essere ottenuto marcando le cellule isolate in un altrimenti non m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
Riferimenti
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