analizando<em> En Vivo</em> Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
En los organismos multicelulares, la migración celular es esencial tanto para el desarrollo del embrión en el que se asegura la organización de células en tejidos y órganos, y para la vida adulta, en el que toma parte de la homeostasis del tejido (cicatrización de heridas) y la inmunidad. Además de estas funciones fisiológicas, la migración celular también participa en diversas situaciones patológicas, incluyendo, en particular, la metástasis del cáncer.
La migración celular se ha analizado in vitro durante décadas, proporcionando una comprensión global de los mecanismos moleculares que garanticen movimientos de la célula en superficies planas. In vivo, sin embargo, las células se enfrentan a un entorno más complejo. Es claramente apareció en los últimos años que la migración dentro de un organismo puede estar influenciada por las señales externas, tales como la matriz extracelular, las células o quimiocinas secretadas migración de guía vecina, y que los mecanismos que impulsan la migración de células puede variar de lo que se ha descrito <em> in vitro 1,2. Los mecanismos que garanticen en la migración celular in vivo han recibido menos atención hasta ahora, principalmente debido a la mayor dificultad técnica, en comparación con los estudios in vitro. In vivo análisis de la migración de células, en particular, requiere de acceso óptico directo a células que migran, las técnicas para marcar las células únicas en para ver su dinámica y morfología, así como ganancia o pérdida de la función se acerca a probar el papel de los genes candidatos. Hasta ahora, sólo unos pocos sistemas modelo que albergan estas características se han utilizado para diseccionar en la migración celular in vivo 3.
Recientemente hemos utilizado la migración de la placa precordal prospectivo en los primeros embriones de pez cebra como un nuevo sistema conveniente modelo para evaluar la función de los genes candidatos en el control de la migración de células en vivo 4,5. prechordal placa prospectivo (también conocido como mesendoderm anterior) es un grupo de células que forman en el inicio de Gastrulation en el lado dorsal del embrión. Durante la gastrulación este grupo migra colectivamente hacia el polo animal del embrión 6-8, para formar la placa precordal, un engrosamiento mesendodermal, anterior a la notocorda, y subyacente a la placa neural. La parte anterior de la placa prechordal dará lugar a la glándula de la eclosión, mientras que su parte posterior, probablemente contribuye a la cabeza mesodermo 9. Gracias al desarrollo externo y la claridad óptica de la embrión de pez, la migración celular puede ser directa y fácilmente observarse en esta estructura.
Trasplante de la célula es una técnica muy potente que permite la creación rápida y fácil de los embriones de mosaico 10. Expresan marcadores fluorescentes citoesqueleto de las células trasplantadas resultados en el etiquetado de las células aisladas, la morfología y la dinámica de las cuales se pueden observar con facilidad. La combinación de esta a la pérdida o ganancia de función se acerca permite el análisis de funciones de las células autónoma de una latagen didato.
El protocolo presentado describe cómo se evaluó la función del componente SIN1 TORC2 en el control de la dinámica de la migración celular y de actina in vivo 5. Pero, como se menciona en los resultados y más discutido, podría ser utilizado para analizar la implicación potencial de cualquier gen candidato en el control de la migración celular in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta una forma fácil de estudiar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo, mediante la combinación de la creación de embriones quiméricos utilizando el trasplante de células con imágenes en directo.
Creación de embriones de mosaico
El estudio de la dinámica de una célula requiere la visualización de su contorno para analizar extensiones citoplasmáticas. Esto se puede lograr mediante el etiquetado de l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
Riferimenti
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