分析<em>インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して>細胞移動
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
多細胞生物において、細胞遊走は、組織や器官への細胞の組織化を確実に胚の発達のために、それが組織の恒常性（創傷治癒）および免疫性に関与する成人用の両方に必須です。これらの生理学的な機能に加えて、細胞遊走はまた、特に、癌転移を含む多様な病的状態に関与しています。
細胞遊走は、平坦な表面上での細胞の移動を確保する分子機構の全体的な理解を提供する、数十年にわたってインビトロで分析された。 インビボではしかしながら、細胞は、より複雑な環境に直面しています。明らかに、移行を誘導する細胞や分泌ケモカイン隣接、そのような細胞外マトリックスとして生体内移行が外部の合図によって影響され得ることは、過去数年に登場し、その記載されているものと異なる場合があり、細胞移動を駆動機構<em>のin vitroで1,2。 生体内の細胞遊走に確保するメカニズムは、in vitro試験に比べて、主に増加した技術的な困難のため、これまであまり注目されてきた。特に、細胞遊走のインビボ分析遊走細胞への直接的な光アクセスを必要とする、でユニークな細胞を標識するためのテクニックその原動力と形態、ならびにゲインまたは機能の損失を見るためには、候補遺伝子の役割をテストするために近づきます。これまでのところ、これらの特性を保有するだけ少数のモデル系は、 インビボ細胞遊走3 に切開するために使用されています。
我々は最近、 生体内の細胞遊走4,5 に制御する際に候補遺伝子の機能を評価するために、新しい便利なモデルシステムとして初期のゼブラフィッシュの胚に前向き脊索前板の移行を使用していました。 （また、前方の中内として知られている）前向き脊索前板はGASTの開始時に形成する細胞群であります胚の背側にrulation。原腸形成時に、このグループをまとめ脊索前板、中内胚葉の肥厚、脊索に前方、および神経板の下にあるを形成するために、胚6-8の動物極に向かって移動します。その後部の可能性が高い中胚葉9を頭に貢献しながら、脊索前板の前方部分は、孵化腺を生じさせます。外部開発及び魚類胚の光学的透明度のおかげで、細胞遊走を直接かつ容易にこの構造では観察することができます。
細胞移植は、モザイク胚10を迅速かつ簡単に作成できます非常に強力なテクニックです。単離された細胞を標識に移植された細胞の結果で蛍光細胞骨格マーカーを発現する、の形態とダイナミクスを容易に観察することができます。機能の喪失またはゲインにこれをアプローチ組み合わせることにより、缶の細胞自律的な機能の分析を可能にしますdidate遺伝子。
提示されたプロトコルは、我々は生体内 5 に細胞遊走およびアクチンダイナミクスを制御する際にTORC2コンポーネントSIN1の機能を評価する方法について説明します。しかし、結果に記載し、さらに説明するように、 インビボでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の潜在的な含意を分析するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ライブイメージングと細胞移植を使用してキメラ胚の生成を組み合わせることにより、 インビボでの細胞遊走における候補遺伝子の役割を研究するための簡単な方法を提示します。
モザイク胚の作成
細胞のダイナミクスを研究することは、細胞質拡張を分析するために、その輪郭の可視化が必要となります。良好な視覚的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
Riferimenti
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