Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
שפעת וירוס (IAV) hemagglutinins להכיר חומצות sialic על פני התא קולטנים תפקודית כדי לזכות הכניסה לתאי. עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV יכול לחצות את מחסום המינים כדי עופות, חזירים, סוסים ובני אדם. וירוסים העופות להכיר חומצה sialic מחוברת גלקטוז הלפני אחרון על ידי הצמדה α2-3 (קולטנים מסוג העופות) ואילו וירוסים האדם מעדיפים להכיר חומצה sialic עם הצמדה α2-6 (קולטנים מטיפוס אנושי). כדי לפקח אם וירוסים העופות מסתגלים קולטנים מסוג אדם, מספר שיטות שניתן להשתמש בהם. microarrays glycan עם ספריות מגוונות של sialosides הסינתטי משמש יותר ויותר להעריך סגוליות הקולטן. עם זאת, הטכניקה הזו לא נעשה שימוש למדידת avidities. מדידת הלהיטות בדרך כלל מושגת על ידי הערכת עקידת hemagglutinin בדילול סדרתי או וירוס גליקנים שנספחו 96-גם צלחות פוליפרופילן קונבנציונליות. ב assay זה, גליקנים עם α2-3 או α2-6 חומצות sialic הם מצמידים את ביוטין שנספחו צלחות streptavidin, או הם מצמידים את polyacrylamide (PAA) אשר לספוג ישירות פלסטיק. יש לנו מיניאטורי משמעותי assay זה על ידי הדפסה ישירות sialosides PAA צמודי עמיתיהם PAA הלא צמוד שלהם בשקופיות זכוכית מיקרו היטב. הגדרה זו, עם 48 מערכים בשקופית אחת, מאפשרת מבחני סימולטני של 6 glycan מחייב חלבונים ב -8 דילולים, חוקר 6 גליקנים שונים, כולל שני פקדים שאינם sialylated. זה שווה 18x 96-גם צלחות ב assay הצלחת המסורתית. פורמט המערך glycan פוחת צריכת תרכובות וביולוגיה ובכך משפר את יעילות.
Introduction
עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV הוא מסוגל לחצות את מחסום המינים כדי עופות ויונקים, כולל בני אדם. IAVS עופות להכיר חומצות sialic α2-3 צמוד (קולטנים מסוג העופות), ואילו וירוסי אדם להיקשר α2-6 חומצות sialic צמודות (קולטנים מסוג האדם). כדי להיות מסוגל לשכפל ביעילות ולהעביר בין בני האדם IAV עופות צריך להיקשר לקולטנים מסוג האדם 1.
IAVS מחולקים לפי סרולוגיה המאפיינת את antigenicity של hemagglutinin שלהם (HA) נורמינידאז גליקופרוטאינים המעטפה (NA). HA נקשר חומצות sialic, ואילו NA הוא האנזים להרוס קולטן בקצה השני של מחזור החיים של נגיפי ודבק sialic חומצה 2. כל הווירוסים מדביקים האדם, כולל H1N1, H2N2 ו H3N2, יש מוצא עופות 3. בשנים של העשורים האחרונים עופות כדי crossovers אדם התרחש, עם H5N1, H7N7, H7N9 ו להיות הכי ידוע; HoweVer, תת אחרים נגועים בני האדם יותר באופן ספוראדי (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. למרבה המזל, נראה כי אף אחד הווירוסים הללו הצליחו להסתגל באופן מלא לקולטנים חומצת sialic אדם מהסוג צמוד α2-6 5-8. הסתגלות של וירוסים zoonotic העופות או אחרים כדי להתאים שכפול והעברת ב המארחים אדם יכול להיות בעל השפעה הרסנית על בריאות האדם. לכן, ידע מוקדם של כמה וירוסים אלה מתפתחים להיקשר לקולטנים אדם מהסוג יעזרו מעקב חובק-עולם של נגיפי שפעת מתעוררים.
קביעת העדפת קולטן הובררה ראשונה באמצעות אריתרוציטים של מינים שונים ונשארת assay מועדף בקרב כל חוקרי שפעת 9-12. ההפגנה כי וירוסים העופות להכיר חומצה sialic α2-3 ווירוסים האדם α2-6 מקושר חומצה sialic התבססה במקור על assay באמצעות hemagglutination של אריתרוציטים מהונדסים enzymatically להכיל כל אחד linkages 13,14. למרות ההודעה היא hemagglutination, assay תקן וירולוגים, מבני glycan הבסיסיים אינם מוגדרים, הצמדת המסוף בלבד. בנוסף, הזמינות המוגבלת של sialyltransferases, המשמש מחדש sialylate התאים, מצמצמת את השימוש של assay זה 15-18. בהמשך לכך, שיטות אחרות של בקביעת העדפות מחייב קולטן הוכנסו באמצעות מבנים glycan sialylated צמוד פולי-acrylamide (PAA) או פולי-גלוטמט (PGA) מבנים מבוססי מבחני צלחת 19,20. כמה וריאציות אפשריות ציפוי גם את גליקנים או וירוסי צלחות microtiter, שכל אחת מהן התוצאה היא assay ELISA מהסוג איתנה, אמינות מאוד רגישה 21-23. לחלופין, גליקנים צמודים ביוטין יכולים להחליף PAA / PGA וניתן מצומדות כדי צלחות streptavidin מצופה 2,24. למרות שהחלק סר ספציפי עשויים להידרש, ELISAs הם גליקנים תקן וכמה צמוד PAA הם בקלות commercially ושאינם זמינים מסחרית (קונסורציום glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org)).
טכנולוגיות microarray glycan צמחו כמו כלי רב ערך כדי לקבוע סגוליות הקולטן, כפי הם הבחינו גליקנים שונים מרובים, והיקשרות מגוון רחב של מבנים שונים ניתן להעריך בתוך assay יחיד 25-29. עקידת IAV במבנים אלו מספקת הבנה טובה יותר של מבנים glycan כי IAV מזהה מועדף 30-33. microarrays glycan דורש כמויות קטנות של נפח דגימה לבצע assay מחייב ורק משתמש בכמויות זעירות של glycan לכל נקודה (2 nl). עם זאת, מערכים אלו משמשים בדרך כלל רק להעריך סגוליים של קולטנים גליקנים. ניתוח של וירוסים מרובים, או חלבוני hemagglutinin, בטווחי ריכוז מרובים יכול להיות מונע בשל מספר השקופיות הנדרשות. יתר על כן, עד כה, לא assay להיטות ביחס פותח באמצעות ar glycanטכניקות ray.
כדי לשלב את דרישת המדגם הנמוכה המוענקת על ידי טכניקות microarray glycan ואת הרגישות של גליקנים צמודים PAA מבחנים מבוססים ELISA, בקשנו לפתח מערך glycan רב גם שיאפשר ניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה דומה או טובה יותר לעומת אל assay ELISA המבוסס המסורתי. במקביל, רצינו לצמצם את כמות ביולוגיות וכימיקלי כתב נצרכו. התוצאה הסופית היא assay להיטות מיניאטורי, שפותחה במיוחד עבור ניטור סגולי IAV והוא ישים באותה מידה להעריך חלבונים מחייבים glycan אחרים. באמצעות שקופיות זכוכית מתחלקות 48-בארות מייקרו ידי מסכת טפלון, 6 גליקנים שונים הם הבחינו ב 6 משכפל לכל טוב. פלטפורמת microarray מקנה המגמות אותו קולטן כריכה לראות בפורמט מאקרו ELISA עם מספר יתרונות. אלה כוללים (I) הדפסה של המתחם ב 6 משכפל, באמצעות מדגם מינימלי, לעומת ציפוי של כמה שורות אניצלחת נה, באמצעות 100 μl לכל היטב; (II) תרכובות שונות מרובות נתחו במקביל באר יחיד, לרבות בקרות; (III) ירידה מסיבית נפח דגירה; (IV) טווח דינמי גדול יותר באמצעות הודעת ניאון. שקופית יחידה ניתן לחשב להיות שווה ערך ל 18x 96-גם הצלחות.
עם הפרוטוקול הבא, מסוגל במעבדה כל בפברוק וניתוח הבחין microarrays אמור להיות מסוגל לייצר פורמט ELISA מיניאטורי זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכה סגולית הקולטן IAV היא צעד חשוב בניתוח פוטנציאל מגיפת וירוסי עופות. הכרת חומצת sialic ידי הנגיף קשור לכמה מאפיינים ביולוגיים כגון קשירה ושחרור מהתא. ידיעה אשר מוטציות-חומצת אמינו נחוצות וירוסי עופות להשיג α2-6 מחייבים ולחצות את מחסום המינים מאפשר מוכן לקראת מגפה. מבח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מתקן Core Microarray סקריפס, וחוזה מן המרכז לבקרת מחלות (JCP). RPdV היא כלת מענק הרוביקון ו Veni מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO). המאגד עבור glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org/) במימון NIGMS מענק GM62116 (JCP) סיפק כמה גליקנים השתמשו במחקר זה. זהו פרסום 29,113 ממכון המחקר סקריפס.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
Riferimenti
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6′-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D’Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
