Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
Virus influenzale A (IAV) emoagglutinine riconoscono acidi sialico sulla superficie delle cellule, come i recettori funzionali per ottenere l'ingresso nelle cellule. uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV può attraversare la barriera di specie di pollame, suini, cavalli e gli esseri umani. virus aviari riconoscono acido sialico attaccato ad un galattosio penultima da un legame α2-3 (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani preferenzialmente riconoscono acido sialico con un α2-6 linkage (recettori di tipo umano). Per monitorare se i virus aviari si stanno adattando ai recettori di tipo umano, possono essere utilizzati diversi metodi. microarray glycan con diverse librerie di sialosides sintetici sono sempre più utilizzati per valutare recettore specificità. Tuttavia, questa tecnica non è utilizzata per misurare avidità. Misurazione della avidità è solitamente ottenuto valutando il legame di emoagglutinina o virus diluiti serialmente per glycans adsorbita convenzionali polipropilene piastre a 96 pozzetti. In questo saggio, glicani con α2-3 o α2-6 acidi sialici sono accoppiati alla biotina e streptavidina adsorbite piastre, o sono accoppiati poliacrilammide (PAA) che adsorbe direttamente alla plastica. Abbiamo notevolmente miniaturizzato questo test stampando direttamente sialosides PAA-linked e le loro controparti non PAA-linked su vetrini micro-bene. Questo set-up, con 48 matrici su una singola diapositiva, permette analisi simultanee di 6 glycan proteine leganti a 8 diluizioni, interrogando 6 glicani diversi, tra cui due controlli non sialylated. Ciò equivale a 18x piastre a 96 pozzetti nel test tradizionale piatto. Il formato di matrice glycan riduce il consumo di sostanze e prodotti biologici e, quindi, migliora notevolmente l'efficienza.
Introduction
uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV è in grado di attraversare la barriera di specie di pollame e mammiferi, inclusi gli esseri umani. IAV aviaria riconoscono α2-3 acidi sialico legati (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani si legano α2-6 acidi sialico legati (di tipo umano recettori). Per essere in grado di replicare in modo efficiente e trasmettere tra gli esseri umani un IAV aviaria ha bisogno di legarsi ai recettori di tipo umano 1.
IAV sono divisi sulla base di sierologia che caratterizza l'antigenicità della loro emoagglutinina (HA) e glicoproteine busta neuraminidasi (NA). HA si lega agli acidi sialici, considerando NA è l'enzima recettore distruggendo all'altra estremità del ciclo di vita virale e si unirà acido sialico 2. Tutti i virus che infettano umani, tra cui H1N1, H2N2 e H3N2, hanno un origine avicola 3. Negli ultimi due decenni molti aviaria ai crossover umani si sono verificati, con il virus H5N1, H7N7, e H7N9 è il più noto; However, altri sottotipi hanno infettato gli esseri umani più sporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Fortunatamente, sembra che nessuno di questi virus sono stati in grado di adattarsi perfettamente al tipo umano α2-6-linked recettori per l'acido sialico 5-8. Adattamento del virus zoonotici aviaria o di altri per ospitare la replicazione e la trasmissione in ospiti umani potrebbe avere un effetto devastante sulla salute umana. Pertanto, prima la conoscenza di come questi virus si stanno evolvendo di legare i recettori di tipo umano aiuterà sorveglianza in tutto il mondo dei virus influenzali emergenti.
Determinazione della preferenza del recettore è stato chiarito con eritrociti di specie diverse e rimane un test favorito tra i ricercatori di influenza 9-12. La dimostrazione che i virus aviari riconoscono acido sialico α2-3 e virus umani α2-6 collegati acido sialico è stato originariamente basato su un test utilizzando emoagglutinazione di eritrociti enzimaticamente ingegnerizzate per contenere ciascuno dei Linkages 13,14. Anche se la lettura è emoagglutinazione, un test standard per virologi, le strutture glycan sottostanti non sono definite, soltanto il collegamento del terminale. Inoltre, la limitata disponibilità dei sialyltransferases, utilizzati per ri-sialylate cellule, hanno limitato l'uso di questo dosaggio 15-18. Successivamente, sono stati introdotti altri metodi per determinare le preferenze del recettore vincolante utilizzando strutture glycan sialylated legati alla poli-acrilamide (PAA) o strutture poli-glutammato (PGA) in saggi piatto a base di 19,20. Diverse varianti sono possibili rivestimento sia i glicani o virus di micropiastre, ciascuna delle quali si traduce in un robusto, affidabile e molto sensibile ELISA-tipo di saggio 21-23. In alternativa, glicani biotina-linked possono sostituire PAA / PGA e può essere coniugato con piastre rivestite di streptavidina 2,24. Anche se alcuni sieri specifici può essere richiesto, ELISA sono glicani standard e diversi legati alla PAA sono prontamente commerciallY e non disponibile in commercio (Consorzio per Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org)).
Tecnologie di microarray glycan sono emersi come uno strumento prezioso per determinare recettore specificità, come più glicani differenti sono macchiati, e vincolante per una vasta gamma di strutture diverse può essere valutata all'interno di un singolo test 25-29. Il legame di IAV a queste strutture fornisce una migliore comprensione delle strutture glicani che IAV riconosce preferenzialmente 30-33. microarrays glycan richiedono piccole quantità di volume di campione per eseguire un esame di legame e utilizza solo piccole quantità di glicani per spot (2 NL). Tuttavia, queste matrici sono tipicamente utilizzati solo per valutare la specificità di glicani recettori. Analisi del virus multipli, o proteine emoagglutinina, in più intervalli di concentrazione può essere proibitivo a causa del numero di vetrini necessari. Inoltre, ad oggi, nessun test di avidità parente è stato sviluppato utilizzando ar glycantecniche di Ray.
Per combinare il requisito del campione basso offerto dalle tecniche di microarray glycan e la sensibilità dei glicani PAA-linked in saggi ELISA-based, abbiamo cercato di sviluppare una serie glycan multi-bene che consentirebbe per l'analisi high-throughput con una risoluzione simile o migliore rispetto al tradizionale test ELISA basato. Allo stesso tempo, abbiamo voluto ridurre al minimo la quantità di prodotti biologici e prodotti chimici giornalista consumati. Il risultato finale è un test di avidità miniaturizzato, appositamente sviluppato per il monitoraggio IAV specificità ed è ugualmente applicabile per valutare altre proteine di legame glycan. Usando un vetrino separato in 48 micro-pozzi da una maschera di teflon, 6 glicani diversi sono macchiati in 6 replicati per bene. La piattaforma microarray offre le stesse tendenze di legame al recettore visti in formato macro ELISA con diversi vantaggi. Questi includono (I) stampa di composto in 6 replicati, utilizzando campione minimo, contro il rivestimento di più righe ina piatto, con 100 ul per pozzetto; (II) più diversi composti analizzati simultaneamente in un unico bene, compresi i controlli; (III) una massiccia diminuzione del volume di incubazione e; (IV) una gamma dinamica più grande con una lettura fluorescente. Una singola diapositiva può essere calcolato come equivalente a 18x piastre a 96 pozzetti.
Con il seguente protocollo, qualsiasi laboratorio capace di fabbricare e analizzare macchiato microarray dovrebbero essere in grado di produrre questo formato ELISA miniaturizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Valutare IAV recettore specificità è un passo importante per l'analisi potenziale pandemia di virus aviari. riconoscimento acido sialico dal virus è legata a diverse proprietà biologiche quali legandosi e rilascio dalla cellula. La conoscenza di quali sono necessarie mutazioni di aminoacidi per i virus aviari per raggiungere α2-6 vincolante e attraversano la barriera di specie consente preparazione alla pandemia. Diversi test sono utilizzati per determinare la specificità del recettore; Tuttavia, tutti hanno i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo Scripps Microarray Core e un contratto dai Centers for Disease Control (JCP). RPdV è un destinatario di una borsa di Rubicon e VENI dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). Il Consorzio per la Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org/) finanziato dalla NIGMS concessione GM62116 (JCP) ha fornito diversi glicani utilizzati in questo studio. Questa è la pubblicazione 29113 da The Scripps Research Institute.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
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