एक संयुक्त 3 डी ऊतक इंजीनियर<em> इन विट्रो</em> /<em> सिलिको</emविशिष्ट mutational पृष्ठभूमि में ड्रग प्रभावशीलता की भविष्यवाणी के लिए> फेफड़े ट्यूमर मॉडल
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
वर्तमान अध्ययन में, हम एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि के आधार पर दवा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अनुकूलन सिलिको मॉडल में एक साथ इन विट्रो 3 डी फेफड़ों के ट्यूमर मॉडल संयुक्त। मॉडल एक decellularized सुअर का पाड़ कि reproduces बाह्य मैट्रिक्स संरचना और तहखाने झिल्ली सहित वास्तुकला के बारे में ऊतक विशेष विशेषताओं पर उत्पन्न होता है। हम एक प्रोटोकॉल है कि नशीली दवाओं के उपचार के तीन दिन सहित 14 दिनों के भीतर कृत्रिम ट्यूमर के ऊतक पीढ़ी की अनुमति देता मानकीकृत। हमारा लेख 3 डी के कई विस्तृत विवरण M30-एलिसा द्वारा supernatants से प्रसार सूचकांक Ki67 धुंधला है, apoptosis के दृढ़ संकल्प और उपकला के आकलन mesenchymal संक्रमण के लिए (EMT), जो की प्रभावशीलता के मूल्यांकन के लिए उपयोगी उपकरण हैं की तरह पढ़ने के लिए बाहर स्क्रीनिंग तकनीक प्रदान करता है चिकित्सकीय यौगिकों। हम 2 डी संस्कृति की तुलना में हमारे 3 डी ट्यूमर मॉडल में प्रसार की कमी relat है कि दिखा सकता हैनैदानिक स्थिति के लिए एड। यह कम प्रसार के बावजूद, मॉडल के रूप में फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइनों HCC827 की तुलना द्वारा दिखाया सही ढंग से बायोमार्कर स्थिति के अनुसार भविष्यवाणी की EGFR -targeted दवा प्रतिक्रियाओं (EGFR -mutated, KRAS जंगली प्रकार) और A549 (EGFR जंगली प्रकार, KRAS – उत्परिवर्तित) tyrosine-kinase अवरोध (TKI) gefitinib साथ इलाज किया। और अधिक उन्नत ट्यूमर कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए, हम EMT लंबे समय तक इलाज से TGF-बीटा -1 के साथ के रूप में vimentin / अखिल cytokeratin immunofluorescence धुंधला द्वारा मूल्यांकन प्रेरित किया। एक प्रवाह बायोरिएक्टर शारीरिक स्थिति है, जो ऊतक पीढ़ी में सुधार करने के लिए संस्कृति को समायोजित करने के लिए नियुक्त किया गया था। सिलिको मॉडल में एक बूलियन में – apoptosis, प्रसार सूचकांक और EMT – इसके अलावा, हम gefitinib उपचार या TGF-बीटा -1 उत्तेजना पर दवा प्रतिक्रियाओं के एकीकरण दिखा। इसके अतिरिक्त, हम एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि और गिनती के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के कैसे दवा प्रतिक्रियाओं समझानेप्रतिरोध के खिलाफ erstrategies भविष्यवाणी की जा सकती है। हमें विश्वास है कि विशेष रूप से अपने में सिलिको विस्तार के साथ इन विट्रो दृष्टिकोण में हमारे 3 डी 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में अधिक यथार्थवादी परिस्थितियों में preclinical दवा के परीक्षण के लिए एक अतिरिक्त मूल्य प्रदान कर रहे हैं।
Introduction
दवा उद्योग उच्च संघर्षण दर भारी लागत 1-5 के कारण नैदानिक चरण में कैंसर के इलाज के क्षेत्र में अप करने के लिए 95% की सामना करना पड़ रहा है। इस घाटे के लिए एक कारण यह तथ्य यह है कि वर्तमान में संभावित नए यौगिकों की प्रभावकारिता कैंसर कोशिका लाइनों के 2 डी सेल संस्कृतियों पर या पशु मॉडल में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग में मूल्यांकन किया जाता है। पशु मॉडलों एक उच्च जटिलता है, लेकिन वहां चूहों और पुरुषों 6.7 के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं। पिछले दशक में, अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर 3 डी मॉडल कैंसर कैंसर कोशिका लाइनों के 2 डी और संस्कृति विवो ट्यूमर 6,8,9 में एक जटिल बीच की खाई को पाटने के लिए उत्पन्न किया गया है। सेल भेदभाव पर है और यह भी संकेत दे पर 3 डी वातावरण के प्रभाव साल पहले कई अध्ययनों में दिखाया गया है (जैसे।, मीना बिसेल) के द्वारा 10,11। आज, कई 3 डी सेल संस्कृति मॉडल ऐसे अंडाकार आकृति संस्कृतियों, हाइड्रोजेल या microfluidic चिप्स 12-16 रूप में उपलब्ध हैं। यहाँ तक कि एचटीएमएल यद्यपिई मॉडल पारंपरिक 2D संस्कृति प्रणालियों की तुलना में जटिलता में वृद्धि, वे ज्यादातर एक ऊतक microenvironment कि ट्यूमर का समर्थन प्रभाव और भी प्रभावों दवा प्रभावकारिता के लिए जाना जाता है की कमी है।
इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक जैविक पाड़ SISmuc (छोटे-आंत-submucosa + म्यूकोसा) नामक एक decellularized सुअर का सूखेपन से ली गई है उस पर आधारित एक 3 डी मॉडल ट्यूमर उत्पन्न। इस प्रकार, ऊतक वास्तुकला और इस तरह के अलग अलग कोलेजन के साथ ही तहखाने झिल्ली संरचना के रूप में ईसीएम के महत्वपूर्ण घटक 17 संरक्षित कर रहे हैं। इस अनूठी विशेषता कार्सिनोमा कि epithelia से पैदा होती है और ठोस ट्यूमर के बारे में 80% शामिल की ट्यूमर मॉडल पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हमारे ऊतक इंजीनियर ट्यूमर मॉडल में प्रसार दर कृत्रिम रूप से उच्च 2 डी संस्कृति में हासिल की दरों की तुलना में कम है। प्रसार दवा प्रभावकारिता का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, औषधि परीक्षण और अधिक समान में हमारे मॉडल में सक्षम हो जाता हैइन विवो करने की स्थिति 17 ट्यूमर।
आदेश में हमारे मॉडल सही ढंग से, हम दो अलग अलग फेफड़ों के कैंसर कोशिका लाइनों है कि उनके EGFR -biomarker स्थिति में मतभेद के लिए यहां उपस्थित डेटा बायोमार्कर निर्भर दवा प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए। इस mutational स्थिति NSCLC रोगियों में नियमित रूप से निर्धारित किया जा करने के लिए शुरू कर दिया है। ऐसे EGFR -inhibitor असर एक सक्रिय EGFR उत्परिवर्तन शो बेहतर परिणामों प्लैटिनम आधारित कीमोथेरेपी 18-21 के साथ उन लोगों की तुलना में ट्यूमर के खिलाफ gefitinib रूप TKIs साथ लक्षित उपचार।
हम कई पढ़ने के लिए बाहर तकनीकों है कि परिसर प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक हैं की स्थापना की। इसके अलावा, के बाद TGF-बीटा -1 उत्तेजना हम ट्यूमर कोशिकाओं में यौगिक क्रिया है कि EMT प्रक्रिया है, जो घातक परिवर्तन 22,23 में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है और जो दवा resistan से जुड़ा है शुरू कर दिया की जांच करने में सक्षम हैंसीई 24।
3 डी मॉडल ट्यूमर लक्षित उपचार, रसायन चिकित्सा, या अच्छा विरोधाभासों के साथ नशीली दवाओं के संयोजन के लिए सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति। आगे बढ़ाने के लिए और दवा स्क्रीनिंग में तेजी लाने और प्रतिरोध का सामना करने के लिए, इस सिलिको अनुकरण में एक से पूरित है। कुछ प्रयोगों के आधार पर, ट्यूमर प्रतिक्रिया दवाओं और उनके संयोजन की एक पूरी श्रृंखला के लिए परिणाम के बारे में सिलिको में भविष्यवाणी की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम की स्थापना की है एक विट्रो में संयुक्त / बायोमार्कर निर्देशित उपचार के पूर्वानुमान के लिए सिलिको ट्यूमर परीक्षा प्रणाली में। इन विट्रो मॉडल इस तरह के एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि पर ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध अंतःविषय क्लीनिकल रिसर्च Wuerzburg के विश्वविद्यालय अस्पताल की (IZKF, अनुदान BD247) के लिए केंद्र और बायर्न फ़िट कार्यक्रम (Heike Walles करने के लिए दी गई) द्वारा प्रायोजित किया गया था।
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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