Комбинированный 3D Tissue Engineered<em> In Vitro</em> /<em> В Silico</em> Lung Опухоль модель для прогнозирования эффективности наркотиков в конкретных мутационные Backgrounds
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
В настоящем исследовании, мы объединили в пробирке модель опухоли легких 3D с силикомарганца в модели для оптимизации предсказания реакции лекарственного средства на основе конкретных мутационный фоне. Модель генерируется на decellularized свиных эшафот, воспроизводящем тканеспецифические характеристики относительно внеклеточной матрицы состава и архитектуры, включая базальную мембрану. Мы стандартизирован протокол, который позволяет генерировать искусственную опухолевой ткани в течение 14 дней, включая три дня лечения наркозависимости. Наша статья содержит несколько подробных описаний 3D считывания методы скрининга , как определение индекса пролиферации Ki67 окрашивания в, апоптоз от супернатантах M30-ELISA и оценки эпителиальной к переходу мезенхимальных (EMT), которые являются полезными инструментами для оценки эффективности терапевтические соединения. Мы могли бы показать по сравнению с 2D-культуры сокращение распространения в нашей 3D модели опухоли, которое RELATред к клинической ситуации. Несмотря на это более низкой пролиферации, модель предсказал EGFR -targeted ответы наркотиков правильно в соответствии со статусом биомаркеров , как показано сравнением линий клеток карциномы легкого HCC827 (EGFR -mutated, KRAS дикого типа) и А549 (EGFR дикого типа, KRAS – мутировали) была обработана ингибитором тирозинкиназы (ИТК) гефитиниб. Для изучения реакции снадобья более продвинутых опухолевых клеток, мы индуцированный EMT путем длительного лечения с TGF-бета-1 по оценке виментина / пан-цитокератина иммунофлуоресцентного окрашивания. Поток-биореактор был использован для регулировки культуры в физиологических условиях, в котором улучшено образование тканей. Кроме того, мы покажем интеграцию реакций лекарственных средств при лечении гефитинибом или TGF-бета-1 стимуляции – апоптоза, пролиферации и индекс ЕМТ – в булевское в силикомарганца модели. Кроме того, мы объясним, как наркотиков реакции опухолевых клеток с определенным мутационного фона и подсчетаerstrategies против сопротивления можно предсказать. Мы уверены , что наша 3D экстракорпоральное подход особенно с его расширением в силикомарганца обеспечивает дополнительную ценность для доклинических испытаний лекарственных средств в более реалистичных условиях , чем в культуре клеток 2D.
Introduction
Фармацевтическая промышленность сталкивается с высокими темпами истирание до 95% в области лечения онкологических заболеваний в клинической фазе вызывает огромные затраты на 1-5. Одной из причин этого дефицита является тот факт, что в настоящее время эффективность потенциальных новых соединений оценивают в крупномасштабных скринингов на клеточных культурах 2D-клеточных линий рака или в моделях на животных. Животные модели имеют более высокий уровень сложности , но есть существенные различия между мужчинами мышей и 6,7. В последнее десятилетие, модели рака 3D с использованием различных подходов были сформированы , чтобы преодолеть разрыв между 2D культуры раковых клеточных линий и комплекса в естественных условиях 6,8,9 опухоли. Воздействие 3D среды на дифференциации клеток , а также на передаче сигналов было показано в нескольких исследованиях лет назад (например., С помощью Mina Bissell) 10,11. Сегодня многие 3D – модели клеточной культуры имеются такие , как сфероида культур, гидрогели или микрожидкостных чипов 12-16. Несмотря на то, Фесе модели повышения сложности по сравнению с традиционными системами 2D культуры, в большинстве случаев они испытывают недостаток в микросреду ткани, который, как известно, опухолевые поддерживающие эффекты, а также влияет на эффективность лекарственного средства.
Для решения этой проблемы, мы получили 3D модель опухоли на основе биологического помост под названием SISmuc (малая кишка-подслизистая + слизистую оболочку) , который является производным от decellularized тощей свиньи. Таким образом, архитектура ткани и важными компонентами внеклеточного матрикса , таких как различные коллагенов, а также структуры базальных мембран сохраняются 17. Эта уникальная особенность имеет решающее значение для опухолевой модели генерации карцином, которые возникают из эпителием и содержат около 80% твердых опухолей. Кроме того, скорость распространения в нашей модели опухоли тканевой инженерии снижается по сравнению с искусственно высокими показателями, достигнутыми в 2D культуре. Поскольку распространение является важным параметром при оценке эффективности лекарственных средств, тестирование на наркотики включена в нашей модели более похожиусловия в естественных условиях 17 опухолей.
Для того , чтобы оценить потенциал нашей модели , чтобы правильно спрогнозировать биомаркеров-зависимый эффективность препарата, мы здесь представить данные для двух различных клеточных линий рака легких , которые отличаются по своему статусу EGFR -biomarker. Этот мутационный статус начал определяться рутинно у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Целенаправленные процедуры с ИТК , такие как EGFR Ингибитор гефитинибом против опухолей , несущих мутации EGFR активируя показать более высоких результатов по сравнению с теми , с платиновой химиотерапии на основе 18-21.
Мы создали несколько методов для чтения, что имеют отношение к оценке эффективности соединения. Кроме того, после того, как TGF-бета-1 стимуляции мы можем исследовать сложные действия в опухолевых клетках , которые начали процесс ЕМТ, который , как полагают, является важным шагом в злокачественной трансформации 22,23 и который соединен с оМ наркотиковCE 24.
3D модель опухоли позволяют мониторинг клеточных конкретных ответов целевых методов лечения, химиотерапии или комбинации препаратов с хорошими контрастов. В целях дальнейшего укрепления и ускорения наркотиков скрининга и столкнуться с сопротивлением, это дополняется в силикомарганца моделирования. На основе нескольких экспериментов, реакция опухоли может быть предсказано в силикомарганца относительно результатов для полного спектра лекарственных средств и их комбинаций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы установили комбинированный в пробирке / в силикомарганца тестовой системе опухоли для биомаркеров наведением предсказаний лечения. Модель в пробирке оценивает различные важные аспекты сложных действий , таких как изменение пролиферации опухолевых клеток и апоптоз на ко?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было организовано Центром междисциплинарных клинических исследований (грант IZKF, BD247) больницы университета Вюрцбурга и программы Bayern Fit (предоставленных Хайке Уоллеса).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
