We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
В настоящем исследовании, мы объединили в пробирке модель опухоли легких 3D с силикомарганца в модели для оптимизации предсказания реакции лекарственного средства на основе конкретных мутационный фоне. Модель генерируется на decellularized свиных эшафот, воспроизводящем тканеспецифические характеристики относительно внеклеточной матрицы состава и архитектуры, включая базальную мембрану. Мы стандартизирован протокол, который позволяет генерировать искусственную опухолевой ткани в течение 14 дней, включая три дня лечения наркозависимости. Наша статья содержит несколько подробных описаний 3D считывания методы скрининга , как определение индекса пролиферации Ki67 окрашивания в, апоптоз от супернатантах M30-ELISA и оценки эпителиальной к переходу мезенхимальных (EMT), которые являются полезными инструментами для оценки эффективности терапевтические соединения. Мы могли бы показать по сравнению с 2D-культуры сокращение распространения в нашей 3D модели опухоли, которое RELATред к клинической ситуации. Несмотря на это более низкой пролиферации, модель предсказал EGFR -targeted ответы наркотиков правильно в соответствии со статусом биомаркеров , как показано сравнением линий клеток карциномы легкого HCC827 (EGFR -mutated, KRAS дикого типа) и А549 (EGFR дикого типа, KRAS – мутировали) была обработана ингибитором тирозинкиназы (ИТК) гефитиниб. Для изучения реакции снадобья более продвинутых опухолевых клеток, мы индуцированный EMT путем длительного лечения с TGF-бета-1 по оценке виментина / пан-цитокератина иммунофлуоресцентного окрашивания. Поток-биореактор был использован для регулировки культуры в физиологических условиях, в котором улучшено образование тканей. Кроме того, мы покажем интеграцию реакций лекарственных средств при лечении гефитинибом или TGF-бета-1 стимуляции – апоптоза, пролиферации и индекс ЕМТ – в булевское в силикомарганца модели. Кроме того, мы объясним, как наркотиков реакции опухолевых клеток с определенным мутационного фона и подсчетаerstrategies против сопротивления можно предсказать. Мы уверены , что наша 3D экстракорпоральное подход особенно с его расширением в силикомарганца обеспечивает дополнительную ценность для доклинических испытаний лекарственных средств в более реалистичных условиях , чем в культуре клеток 2D.
Фармацевтическая промышленность сталкивается с высокими темпами истирание до 95% в области лечения онкологических заболеваний в клинической фазе вызывает огромные затраты на 1-5. Одной из причин этого дефицита является тот факт, что в настоящее время эффективность потенциальных новых соединений оценивают в крупномасштабных скринингов на клеточных культурах 2D-клеточных линий рака или в моделях на животных. Животные модели имеют более высокий уровень сложности , но есть существенные различия между мужчинами мышей и 6,7. В последнее десятилетие, модели рака 3D с использованием различных подходов были сформированы , чтобы преодолеть разрыв между 2D культуры раковых клеточных линий и комплекса в естественных условиях 6,8,9 опухоли. Воздействие 3D среды на дифференциации клеток , а также на передаче сигналов было показано в нескольких исследованиях лет назад (например., С помощью Mina Bissell) 10,11. Сегодня многие 3D – модели клеточной культуры имеются такие , как сфероида культур, гидрогели или микрожидкостных чипов 12-16. Несмотря на то, Фесе модели повышения сложности по сравнению с традиционными системами 2D культуры, в большинстве случаев они испытывают недостаток в микросреду ткани, который, как известно, опухолевые поддерживающие эффекты, а также влияет на эффективность лекарственного средства.
Для решения этой проблемы, мы получили 3D модель опухоли на основе биологического помост под названием SISmuc (малая кишка-подслизистая + слизистую оболочку) , который является производным от decellularized тощей свиньи. Таким образом, архитектура ткани и важными компонентами внеклеточного матрикса , таких как различные коллагенов, а также структуры базальных мембран сохраняются 17. Эта уникальная особенность имеет решающее значение для опухолевой модели генерации карцином, которые возникают из эпителием и содержат около 80% твердых опухолей. Кроме того, скорость распространения в нашей модели опухоли тканевой инженерии снижается по сравнению с искусственно высокими показателями, достигнутыми в 2D культуре. Поскольку распространение является важным параметром при оценке эффективности лекарственных средств, тестирование на наркотики включена в нашей модели более похожиусловия в естественных условиях 17 опухолей.
Для того , чтобы оценить потенциал нашей модели , чтобы правильно спрогнозировать биомаркеров-зависимый эффективность препарата, мы здесь представить данные для двух различных клеточных линий рака легких , которые отличаются по своему статусу EGFR -biomarker. Этот мутационный статус начал определяться рутинно у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Целенаправленные процедуры с ИТК , такие как EGFR Ингибитор гефитинибом против опухолей , несущих мутации EGFR активируя показать более высоких результатов по сравнению с теми , с платиновой химиотерапии на основе 18-21.
Мы создали несколько методов для чтения, что имеют отношение к оценке эффективности соединения. Кроме того, после того, как TGF-бета-1 стимуляции мы можем исследовать сложные действия в опухолевых клетках , которые начали процесс ЕМТ, который , как полагают, является важным шагом в злокачественной трансформации 22,23 и который соединен с оМ наркотиковCE 24.
3D модель опухоли позволяют мониторинг клеточных конкретных ответов целевых методов лечения, химиотерапии или комбинации препаратов с хорошими контрастов. В целях дальнейшего укрепления и ускорения наркотиков скрининга и столкнуться с сопротивлением, это дополняется в силикомарганца моделирования. На основе нескольких экспериментов, реакция опухоли может быть предсказано в силикомарганца относительно результатов для полного спектра лекарственных средств и их комбинаций.
Мы установили комбинированный в пробирке / в силикомарганца тестовой системе опухоли для биомаркеров наведением предсказаний лечения. Модель в пробирке оценивает различные важные аспекты сложных действий , таких как изменение пролиферации опухолевых клеток и апоптоз на ко?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было организовано Центром междисциплинарных клинических исследований (грант IZKF, BD247) больницы университета Вюрцбурга и программы Bayern Fit (предоставленных Хайке Уоллеса).
Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
Moisture chamber | custom made | ||
Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |