miRNA의를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현의 임상 병리학 적 분석<em> 현장에서</em> 하이브리드
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
유방암은 전세계 여성 인구에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 유방암의 130 만 이상의 경우는 전 세계적으로 1, 2 매년보고됩니다. 종양 세포 전통적 생물학적 균질 높은 증식으로 간주되었지만, 유방암 유전자 임상 이질적인 것을 분명하게 하였다. 유행 항암제에 대한 내성은 암의 진행과 전이 거리 (3)의 촉진을 통해 대부분의 환자에서 사망에 이르는 고급 유방암의 특징이다.
마이크로 RNA (miRNA가)의 mRNA의 번역을 차단하거나 mRNA의 분해 4 중개하여 유전자 발현을 조절하는 약 22 개의 뉴클레오티드 작은 RNA 분자 클래스이다. 2,000 개 이상의 다른의 miRNAs 지금까지 인간의 질병 (5)에 연결되어 인간에서 발견되었습니다. 연구의 증가 배열은 근래전자는의 miRNAs는 종양 유전자와 종양 억제 기능을 할 수 종종 종양 6 조절 곤란 것을 보여 주었다. miRNAs는 강하게 종양 세포 운동성, 침윤 및 전이 (7)의 것들과 함께, 세포주기 진행, 노화, 세포 사멸 및 자식 작용의 주요 레귤레이터를 제어하여 일차 종양 모두 영향을 미친다.
비정상적인 miRNA의 발현은 또한 무대, 분화, 예후 및 보조 요법 (8)에 대한 응답으로 임상 적 의미와 연결되었습니다. 특히 미르-146의 발현은 폐암 환자 9의 불량한 예후와 관련되어 증가 하였다. 또 다른 연구의 miRNA-let7b의 손실 발현이 결과적으로 가난한 생존 6, 악성 표현형에 연결되어 있음을 보여 주었다. miRNAs의 발현이 세포 구조의 유형을 이해하는 것은 메커니즘을 이해하는데 중요한 부분되는 miRNA의 발현에 영향을 미치는 셀 변경 및조직은 10 표현형. 간질 세포에서 분비되는 것으로 밝혀 특정 miRNAs의 상피 세포에서 찍은 구체적 목표물에 작용한다. 같은 맥락에서 미르-212은 miR-132는 유선 개발 11시 유관 가지에 필요한 상피 세포 – 기질 상호 작용을 기질에 의해 분비와 조절된다. 이 논문의 전반적인 목적은 계내 혼성화에 miRNA를 통해 유방암 조직에서의 miRNA 발현을 검출하는 상세한 프로토콜을 설명하는 것이다. 우리는 유방암 환자 샘플에서의 miRNA-489의 발현 수준을 분석하기 위해 모든 조건을 최적화했다. 이를 위해, 우리는 표시된 DIG는 우리의 실험에서 핵산 (LNA) 프로브를 고정 사용. 그 뉴클레오티드의 일부, 즉,는 LNA 수정 있던 2 '산소 원자 및 4'는 혼성화 후 "의 위치에 고정"상태로 유지되도록 염기를 해결 리보스 골격의 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 다리. 그 결과, 훨씬 더 어렵다혼성화 단지는 12, 13를 변성하기 위해.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 목적은 현장에서 miRNA의 혼성화를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현 수준을 결정 하였다. 본 실험에서 모든 조건 유방암 조직에 최적화 된 것을 유의하여야한다. 또한 최적화는 다른 조직 유형에 필요한 될 수 있습니다. 모든 솔루션은 DEPC 물로 만든되어야하며, 모든 컨테이너는 DEPC 처리 수로 세척하고이어서 멸균해야 사용할 수 있습니다. 비록 약간의 오염 된 RNase 실험의 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
Riferimenti
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
