Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Meme kanseri dünya genelinde kadın nüfusu etkileyen en yaygın maligniteler arasında yer alıyor. Meme kanseri 1.3 milyon vaka dünya çapında 1,2 yılda bildirilmektedir. Tümör hücreleri, geleneksel biyolojik homojen ve yüksek proliferatif olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, meme kanseri genetik ve klinik heterojen olduğunu belirgin hale gelmiştir. Yaygın antikanser ilaçlara direnç kanser ilerleme ve mesafe metastazı 3 onun kolaylaştırılması yoluyla hastaların çoğunluğunda mortaliteye neden ilerlemiş meme kanserlerinin bir özelliğidir.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) mRNA translasyonunu bloke veya mRNA bozulmasını 4 aracılık gen ekspresyonunu düzenleyen yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda küçük RNA molekülleri sınıfıdır. 2.000 'den fazla farklı miRNA'lar kadar insan hastalıkları 5 ile bağlantılı olan, insanları tespit edilmiştir. çalışmalar artan bir dizi havE miRNA'lar onkojenlerin ve tümörleri giderici olarak işlev görebilir ve genellikle tümör 6 düzensiz olduğunu göstermiştir. miRNA'lar kuvvetle tümör hücre hareketi, invazyon ve metastaz 7 olanlarla birlikte hücre döngüsü ilerlemesinin, yaşlanma, apoptoz ve otofaji önemli regülatörleri kontrol ederek birincil tümörogenez tüm etkileyebilir.
Aberrant miRNA ifade aynı zamanda sahne, farklılaşma, prognozu ve adjuvan tedavi 8 yanıt olarak klinik etkileri ile ilişkili olmuştur. Özellikle, miR-146 ifadesi akciğer kanserli hastalarda 9 kötü prognoz ile ilişkilidir arttı. Başka bir çalışmada, miRNA let7b kayıp sentezleme Sonuç olarak, zayıf yaşama 6, habis fenotipler ile bağlantılı ve göstermiştir. miRNA'lar ifade eden hücrelerin ve yapı türlerini anlamak olduğunu mekaniğini anlamak önemli bir parçası geçtiği miRNA ifade etkisi hücrede değişiklikler veDoku 10 fenotip. stromal hücrelerde salgılandığı bulunmuştur belirli miRNA'ların epitel hücreleri tarafından alınır ve özel olarak hedef doğrultusunda hareket edilir. Aynı şekilde, miR-212 ve miR-132 meme bezi gelişimi sırasında 11 duktal büyümesi için gerekli epitel-stromal etkileşimleri stroma tarafından salgılanan ve regüle edilir. Bu çalışmanın genel amacı in situ hibridizasyon miRNA ile meme kanseri dokularında miRNA ifade algılamak için ayrıntılı bir protokol açıklamaktır. Biz meme kanseri hasta örneklerinde miRNA 489 ifadesinin seviyelerini analiz etmek için tüm şartları optimize ettik. Bu amaçla, işaretlenmiş DIG eden deneyde nükleik asit (LNA) prob kilitli kullanılır. Bunu nükleotid bazı, yani, bir LNA modifikasyonu sahip 2 ', oksijen atomu ve 4' de hibridizasyon sonrası "yerine kilitli" kalacak şekilde nükleotidi giderir riboz omurga karbon atomu bağlayan bir metilen köprüsü. Bunun bir sonucu olarak, çok daha zorhibridize kompleksi 12,13 denatüre etmek için.
Bu çalışmanın amacı, in situ hibridizasyon miRNA kullanarak meme kanseri dokularında MiRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için yapıldı. Deneyde, tüm koşullar meme kanseri dokusu için optimize olduğu not edilmelidir. Ayrıntılı optimizasyon diğer doku tipleri için gerekli olabilir. Bütün çözeltiler DEPC su ile yapılmalıdır ve kaplar DEPC işlenmiş, su ile durulandı ve daha sonra otoklavlanmalıdır kullanılır. Hatta hafif RNaz kirlenme deney nihai sonucu etkileyebilir. MiRNA çok k?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
ELF-97 | Life technology | E6604 | |
50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |