Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi
Summary
Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
Abstract
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
Introduction
En sık rastlanan primer intrakranial malign beyin tümörleri evre III astrositom ve Evre IV glioblastoma multiforme (glioblastoma veya GBM) bulunmaktadır. ABD 1-3 GBM için geçerli tedavilerle 15 ay – Bu tümörler 12 arasında ortalama bir yıllık sağkalım yoksul prognoz sunuyoruz. Çok modelli tedaviler temozolomid (TMZ) ve kinaz hedefli ajanlar da dahil olmak üzere cerrahi, radyasyon ve kemoterapi yer alıyor. Kinaz sinyal sık Epidermal Büyüme Faktörü reseptörü (EGFR), Trombosit Türevli Büyüme Faktörü Alıcısının (PDGFR) artışlar sinyal, artan Fosfatidil-inositol-3 kinaz (PI3K) ve amplifikasyon ile tümör alt-veya aktive mutasyonlar da dahil olmak üzere, GBM'de düzensiz olan Vasküler Endotel Büyüme Faktörü Alıcısının (VEGFR) hem de diğer kinaz tahrik yollar 4-6 ile anjiyojenik sinyal destekleyici tümörü. Vitro ve in vivo modelleri sık sık bu temsili değişiklikleri kaybetmek Güncel <sup> 7. Buna ek olarak, genetik profilleme genetik ve epigenetik değişiklikler her zaman hedefleme ajanları çoğu kinaz doğrudan hareket protein aktivite düzeyi, değişiklik tahmin yok ve eylem diğer mekanizmalar ile tedaviler nerede hareket edebilirler gerçeğini yansıtıyor olabilir beklenen faydalar teklif yok dolaylı olarak.
sonsuza pasajlandı edilebilir geleneksel ölümsüzleştirdi hücre hattı uzun nedeniyle bakım ve tekrarlanabilirlik kendi kolaylığı uyuşturucu testi için standart olmuştur. Ancak, bu model hızlı orijinal tümörden önemli ölçüde farklıdır hücrelerin büyümesi için seçer yüksek besin (ve yapay) bir büyüme ortamına muzdarip. Bunun gibi, hastanın mevcut olduğu gibi daha karmaşık tümör biyolojik sistemi yansıtacak daha gerçekçi bir model sistemlerinin geliştirilmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Tümör ksenogrefleri farelerde yetişen bir primer tümörün ( "xenoline," hasta-türevi xenograftlarının veya PDX) yazarlara doğrudan geliştirilenOnlar daha güvenilir klinik başarısını tahmin etmek. 8 daha yansıtıcı biyoloji rağmen keçe gibi de özellikle kanser tedavi ortamında bir daha yansıtıcı bir model sistem, bu modeller pahalıdır ve kurmak ve sürdürmek zordur. Ayrıca, yüksek verimli çalışmalar için uygun değildir. Gerek daha daha doğru genetik belirteçleri vekil değil, birincil tümörlerde moleküler değişikliklerin yansıtmak ve profil ve kinaz aktivitesinin doğrudan önlemler kullanarak bu modelleri test biyolojik modellerin geliştirilmesi, açıktır.
Iki-boyutlu (2B) tek tabakalı kültürler farklı olarak, 3 boyutlu veya çok-hücreli deney modelleri daha fazla fizyolojik olarak ilgili son noktaları 9-11 sağlayabilir kabul edilmektedir. Ortak 3D kültür matris kaplı mikrotaşıyıcılar ve hücre sfero oluşumunu içeren yaklaşımlar. Tümör Sferoidler spinner şişesi, PHEMA plaka kullanarak ve bırak teknikleri asılı hücresel toplama yoluyla elde edilebilir. t Sınırlamalarhese yaklaşımlar şunlardır: bazı hücreler karışık hücre tipleri ile istikrarlı parçacıklarının, değişkenliği büyüme ve zorlukları oluşturmak için yetersizlik. Seçenek olarak ise, bir çok sentetik (hidrojel polimer) ve Engelbreth-Holm-Swarm matrisler 3D kültür için geliştirilmiş olan fare sarkom den (EHS) matris, bovin kolajen) 12-14 çalışmalar hayvan türevi. Farenin EHS matrisi yaygın olarak kullanılan, ancak in vitro ve in vivo 15 hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik ettiği bilinir.
3D tümör biyolojisi çoğaltmak için, bir insan biyomatris sistemi Dr. Raj Singh ve ark., 16 tarafından geliştirilmiştir. Doğal, büyüme faktörü içermeyen insan BioGel birden fazla hücre tipleri uzun süreli yetiştirme destek 3D kültür iskeleleri (boncuklar, diskler) izin verir. 3D insan BioGel kültür tasarımları bir dizi tümör büyümesi, yapışma, anjiyogenez ve işgali özelliklerini incelemek için kurulmuştur. Avantajları ve insan BIOGEL özellikleri ortak karşılaştırıldığındafare EHS jeller Tablo 1 ve Tablo 2'de özetlenmiştir.
| Kaynak: | İnsan Amnions (toplanan doku) Patojen içermeyen, IRB muaf / onaylı |
| ECM doğa: | Sigara denatüre BIOGEL (GLP-üretim) |
| Anahtar bileşenleri: | Col-I (% 38), laminin (% 22), col-IV (% 20), col-III (% 7), entactin ve HSPG (<% 3) |
| GF-serbest: | Saptanamaz EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-anjiyogenik, toksik olmayan) |
Tablo 1: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL özellikleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = "always">Tablo 2: Ortak EHS Gels karşılaştırıldığında İnsan BIOGEL avantajları.
Protocol
Representative Results
Discussion
protokolü içinde kritik adımlar ağırlıklı nesil yanı sıra ilaç dozajı ve bakım microtumor ilgilidir. microtumor boncuk kırılgan ve kolayca yırtılmış olduğu için, son derece dikkatli bir tahlil ve bakım gelişim evreleri, hem de ihtiyaç vardır. Bir hata Bu işlemlerden birini sırasında oluşursa, deneysel yorumlama uzantısı veya deneylerin gereksiz tekrarını hatta veri dışlanmasını neden tehlikeye girebilir.
Değişiklikler ve sorun giderme, özellikle microtu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, Beyin Tümörü SPORE ödülü (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) ve SBIR sözleşmesi (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026): NIH R21 hibe (C. Willey, CA185712-01 PI) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |
Riferimenti
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
