Summary
이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.
Introduction
차 유방 종양에서 종양 세포의 보급은 대 식세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 기질 세포뿐만 아니라 종양 세포를 포함하지만, 호스팅하는 것으로 나타났다. 또한, 종양 혈관 투과성 증대 1 이상이다. 따라서, 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포가 일차 종양 미세 혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation을 중재 상호 작용하는 방법을 결정하는 단계 이해 전이에 중요하다. 혈관 투과성, 종양 세포 intravasation 종양 미세 환경에 다세포 상호 작용의 기본 신호 메커니즘의 동역학을 이해하는 항암 치료제의 개발 및 관리에 중요한 정보를 제공 할 수있다.
생체 내에서 종양 혈관 투과성 연구의 주요 수단은 에반스 블루 2, 고 분자량의 덱스 트란 (155 kDa의) 혈관 외 염료로 측정했다염료의 주입 후 일정한 시간 점 (3)과 형광 또는 (알부민을 포함) 추적자 공역 단백질 4. 현미경의 발전은, 동물 모델 및 형광 염료는 생체 내에 현미경 (5)를 통해 세포 과정과 살아있는 동물의 혈관 투과성의 시각화를 사용할 수있다.
여러 시점에 걸쳐 정적 인 이미지, 또는 짧은 시간 경과 시퀀스의 인수와 라이브 동물 이미징은 종양 미세 환경 6,7 동적 이벤트의 완전한 이해를 허용하지 않습니다. 실제로, 24 시간의 과정을 통해 정적 이미지 획득은 종양 혈관 그러나 혈관 투과성의 역학은 6 관찰되지 않았다 새는 것을 보여 주었다. 따라서 12 시간까지 연장 된 연속 시간 경과 영상은 종양 미세 환경에서 동적 이벤트의 반응 속도를 캡처합니다.
이 프로토콜은 확장 된 시간 경과 multiphot의 사용을 설명합니다생체 내에 현미경에 종양 미세 환경에서 동적 다세포 이벤트를 공부합니다. 종양 미세 환경의 여러 세포 유형은 주사 염료 또는 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여 표시되어 있습니다. 혈관 염료 또는 단백질 촬상 개시 후 주입 될 수있는 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 종양 미세 환경에 다세포 이벤트 운동 데이터를 획득한다. 생균 이미징 유방 종양 피부 플랩 수술 준비를 통해 노출된다. 이미지는 다수의 광전자 증 배관 튜브 (PMT) 검출기 (8)를 구비 한 다 광자 현미경을 이용하여 12 시간 동안 획득된다. 적절한 필터를 사용하여 감산 알고리즘 종양 미세 구 동시에 5 형광 신호를 획득하도록 4 PMT 검출기를 가능하게한다. 고해상도의 광자 생체 내에 현미경 더 이어지는 종양 미세 환경에서 종양 - 기질 상호 작용의 단일 셀의 고해상도 영상을 캡처 U혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation 10-13 nderstanding. 특히 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포 간의 상호 작용 부위에서 선택적으로 발생하는 확장 된 생체 내에 촬상 밝혀 고도로 국부 일시적인 혈관 투과성 이벤트가도 13의 (전이 TMEM 14 종양 미세 환경으로 정의). 또한, 종양 세포는 intravasation TMEM 발생 공간적 및 시간적 혈관 투과성 (13)와 상관된다. 이러한 이벤트의 역학의 단일 셀 해상도는 종양 미세 환경에 형광 표지 된 세포의 확장 시간 경과 광자 현미경의 사용을 통해 가능하게되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
설명하는 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다.
1. 생성 형광 표지 된 종양 및 종양 관련 대 식세포
- 강화 된 녹색 형광 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복, 즉 형광 기자 [와 형질 전환 마우스와 폴리오 중간에 T 항원 (MMTV-PyMT)를 구동하는 자연, 토착, 유전자 조작 마우스 유방암 모델을 교차하여 형광 표지 된 종양 세포를 생성 단백질 (EGFP), 향상된 시안 형광성 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군 또는 Dendra2] -8,9-.
- PyMT 동물에서 형광 라벨 식세포와 형광 [즉, MacGr myeloid- 및 macrophage- 특정 형광 기자들과 유 전적으로 조작 된 마우스 모델을 교차하여 종양 세포를 표지EEN 15 MacBlue 마우스 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- 대안 적으로, 형광 형광 표지 PyMT 종양 세포 (동계) 인간 유방암 세포주 또는 일차 인간 환자 유래의 종양 (이종) (11, 17)의 동 소성 이식을 통해 종양 표지 생성한다.
- 임플란트 형광 형광 표지 된 종양 세포와 골수 세포를 13 동물을 생성하는 형광 단백질 표지 된 골수 세포 동계 마우스에 PyMT 종양 세포를 표지.
- 시작 2 시간 전에 형광 라벨 식세포 인간 세포주 또는 환자 유래 차 종양의 이종 이식 종양 중증 합병 면역 결핍증 (SCID) 마우스에 10 mg을 정맥 주사 (IV) 꼬리 정맥에 의해 / kg 형광 70 kDa의 덱스 트란의 100 μl를 주입 생체 내에 이미징.
2. 현미경 설정 및 이미지 준비
참고 :이 절차는 셋업을 설명합니다광자 현미경 8 생체 내에 이미징.
- 두 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경과 레이저 구성 요소의 전원을 켭니다.
- 무대를 미리 따뜻한 30 ° C로 가열 상자를 켭니다. 이 단계는 동물의 생리 학적 온도를 유지하는데 중요하다.
- 거꾸로 현미경 장소 현미경 무대에서 주문 제작 단계 인서트에 사용. 사용자 지정 삽입 이미징을위한 중앙에 관통 구멍 직경 "무대 삽입 공간과 1 맞게 가공 두께의 알루미늄"1/8의 장이다.
- 70 % 에탄올과 공기 건조와 현미경 스테이지와 무대 삽입을 닦습니다.
- 커버 유리와 광학 접촉을 유지하기 위해 20 배, 1.05 NA 현미경의 목적에 물 큰 드롭 놓습니다.
- 현미경 스테이지 인서트 촬상 포트 위에 배치 용 커버 유리 (두께 1.5 #). 실험실 테이프와 장소에 고정합니다.
- 2cm X 2cm의 구멍을 펀치 구멍 펀치를 사용하여그리고 유연한 고무 패드에 사용자 지정 단계 인서트의 구멍과 정렬 패드의 구멍 현미경 무대에 고무 패드를 배치합니다.
이미징 동안 주입 3. 꼬리 정맥 카테터의 준비 및 시약
- 폴리에틸렌 (PE) 관의 30cm 길이를 잘라.
- 이 플라스틱 피팅 떨어져 중단 될 때까지 집게를 사용하여 앞뒤로 31 G 바늘의 금속 바늘을 이동합니다.
- 집게를 사용하여 PE 관으로 분리 된 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입합니다.
- 체육 튜브의 다른 쪽 끝으로 31 G 바늘을 삽입합니다.
- 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 1 cc의 주사기를 입력하고 31 G 바늘에 삽입하고 PBS로 튜브와 바늘에서 모든 공기를 세척합니다. PBS 수화 혈액 9,18 삼투압을 유지하기 위해 사용되며, 그러나 식염수도 사용될 수있다.
- 3 mg을 200 μL와 1 cc의 주사기를 채우기 / 155 kDa의 덱스 트란 - 테트라 메틸 (TMR을 kg을) 또는 혈관 표시를위한 양자 도트를 사용합니다.
- 이러한 얼음 1 공통 주사기 대신 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA 165)의 165 아미노산 동종 같은 다른 주사 단백질을 준비한다. 0.05 ㎎ / ㎖의 농도로 0.2 ㎎ / ㎏ VEGFA 165 19 주사.
내주 꼬리 정맥 카테터 4. 삽입
- 캐리어 가스로서, O2와 5 %의 이소 플루 란 유도 챔버를 사용하여 마취하에 동물을 놓는다.
- 완전히 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 일단 수술 플랫폼에 마우스를 전송합니다.
- 수술 플랫폼 오픈 이소 플루 란 마취 라인은 유도 챔버에 마취 라인을 닫고 동물의 주둥이를 통해 코 콘을 배치합니다. 2.5 %로 5 %에서 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 안과 연고를 적용합니다.
- 가열 램프하에 동물 히트추가로 2 분에 꼬리 혈액 순환을 증가시키기 위해 순환 깊은 마취 둔화.
- 70 % 에탄올로 마우스의 꼬리 정맥을 소독.
- 동물의 측면 꼬리 정맥에 3 장으로 구성 카테터에서 31 G 바늘의 끝을 삽입하고 2-3mm의 바늘을 밀어 넣습니다.
- 꼬리 정맥에 배치됩니다 카테터를 보장, 피를 볼 주사기에 다시 당깁니다.
- 꼬리의 길이를 따라 정맥에 장소 병렬로 바늘을 잡고 바늘 위에 배치 실험실 테이프의 1cm 길이를 사용합니다.
5. 피부 플랩 수술은 유방 종양을 노출
- 수술 플랫폼에서 동물 종양 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 면봉. 참고 : 한 바와 같이,이 절차는 완전히 무균 수행되지 않습니다. 감염은 교란 요인이 될 수있는 긴 촬상 세션 들어, 적절한 무균 기술을 사용하도록 권장한다.
- steri 사용멸균 가위는 복부 중간 선 길이 약 1cm 따라 피하 절개를 함께 제작 포셉은 복부 피부를 들어 올려. 절개 동안 복막을 천공하지 마십시오.
- 부드럽게 유방 종양을 노출 멀리 복막에서 유선 종양을 부착 결합 조직을 잘라.
- 조심스럽게 분리하고, 종양 혈관의 무결성을 유지하는 출혈을 최소화하면서 종양의 노출 된 표면에서의 밴드와 지방 절취 위 및 집게를 사용. 이 단계는 종양의 종양 맥관 구조와 공급을 유지하는데 중요하다.
현미경 6. 동물 준비
- 이미징을위한 현미경 목표를 통해 무대 삽입에 커버 슬립에 배치 노출 된 종양으로 사전 예열 영상 무대에 동물을 전송합니다. 니들을 제거하지 않도록 동물 부드럽게 꼬리 정맥 카테터를 전송하기 위해주의한다.
- 장소 일동물의 주둥이를 통해 전자 마취 코 콘은 3 % 이소 플루 란으로 마취 세트를 유지합니다.
- 종양이 고무 패드의 구멍에 달려 유리 커버 슬립으로 접촉되도록 배치 동물.
- 조심스럽게 제자리에 종양을 잡고 이미지 수집하는 동안 움직임을 줄이기 위해 실험실 테이프로 현미경 무대를 해결하기 위해 두 개의 고무 패드를 사용합니다.
- 수화 조직을 유지하고 coverslip에 광학 접촉을 유지하기 위해 PBS와 고무 패드의 챔버를 입력합니다.
- 펄스 산소 농도계 프로브와 동물의 생체 신호 모니터링을 시작합니다. 동물의 허벅지에 클립 센서를 부착합니다. 대안 목 맞게 구성되는 칼라를 사용할 수있다.
- 30 ° C (20)을 유지하기 위해 동물을 통해 가열 상자를 놓습니다.
- 천천히 마취를 유지하고 혈류를 유지하기 위해 0.5 %의 이소 플루 란의 수준을 감소시킨다.
7. 이미지 인식 및 Fluoresc 사출엔트 염료 및 주사 단백질
- 종양의 표면에 형광 종양 세포의 현미경 접안 렌즈 초점 사용.
- 혈관을 흐르는 영역을 찾아 관심의 영역을 선택합니다. 흐르는 혈관와 관심 영역의 선택은 종양 혈관을 평가하는데 중요하다.
- 관심 영역이 선택되면 광자 촬상 모드로 전환 현미경.
- A부터 Z 시리즈의 상한값과 하한값을 설정한다. 원하는 시작 위치로 이동 목표 포커스 조절 장치를 사용하고, Z 위치 "최고"버튼을 클릭하여 Z 시리즈의 상한을 설정한다. 제 2 고조파 발생 (SHG) 채널에서의 종양의 표면의 콜라겐 섬유 네트워크 시각화 어떠한 세포 만 콜라겐 섬유를 볼 수 없을 때 관찰하여 Z 시리즈의 상한을 결정한다.
- (typica 원하는 촬상 깊이 대물 이동하여 Z 시리즈의 하한을 설정에서야 베드로 50-150 μm의)와 Z 위치를 클릭 "바닥"버튼을 누릅니다.
- 스텝 사이즈 필드에 원하는 값을 입력하여 스텝 사이즈를 설정한다. 해상도 획득 시간에 대한 고려에 기초하여 스텝 크기를 결정하는 (전형적으로 2 ㎛의은 고해상도 3D 재구성에 사용이 5㎛ 달리한다).
- 시간 경과 필드에 원하는 경과 시간을 타임 랩스 패널로 전환하고 입력하여 시간 경과 간격을 설정합니다. 최적의 시간 해상도 연속 촬상 0 초까지의 시간 간격을 설정한다. 참고 : 장시간 경과 이미징하는 대물 침지 액체를 보충하기 위해 인수 사이에 10 초까지의 시간 간격을 설정할 것을 추천한다.
- 영상에 대한 매개 변수가 결정되고 나면, 천천히 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입.
- 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 리에 모든 거품을 소개하지 않는 155 kDa의 덱스 트란 - TMR 돌보는이 들어있는 주사기로 교체네브라스카.
- 천천히 200 μL의 최대 볼륨, 마우스에 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입, 주사기는 PBS를 포함하여 주사기를 교체합니다. 중요한 단계 : 천천히 주입을 수행하고 정맥의 외부 솔루션을 입지 않도록 예방 조치를 취해야.
- 레코드 버튼을 클릭 한 다음 그들을 우울하게하는 Z-스택 및 시간 경과 버튼을 클릭하여 Z-스택 시간 경과 이미징의 인수를 시작합니다.
- 다른 형광 덱스 트란, 즉, 10 kDa의 덱스 트란 - 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC), 또는 단백질, 즉, VEGFA (165)는, 미리 준비되어있는 경우, 0 =에서 분 시작을위한 이미지 수집의 시작 후에 주입.
- 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 라인에 모든 거품을 소개하지 않는 10 kDa의 덱스 트란-FITC 또는 VEGFA 165 돌보는이 들어있는 주사기로 교체합니다.
- 천천히 꼬리 정맥 카테터를 통해 마우스에 주사제를 주입와 PBS가 포함 된 주사기와 주사기를 교체합니다.
- 매 30-45 분 천천히 동물의 수화를 유지하기 위해 PBS 또는 식염수 50 ㎕를 주입.
8. 안락사
- 이미지 수집의 종료에, 동물을 안락사.
- 5 %로 이소 플루 란을 늘립니다.
- 그것은 호흡과 무대에서 동물을 제거하기 위해 중단 후 30 초까지 5 % 이소 플루 란에서 동물을 유지합니다.
- 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.
9. 이미지 처리
- 각 시점에서 각 채널에 대한 16 비트 TIFF 파일로 이미지를 획득하고 순차적으로 저장한다.
- 스펙트럼 중첩 (즉, GFP 및 CFP), XY 드리프트의 제거 및 ImageJ에 9 년에 설립 된 방법을 사용하여 시간 경과 시퀀스에서 영화의 세대 분리를 수행합니다. 고해상도 이미지 (13)의 3 차원 표면의 재구성을 수행.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
연장 시간 경과 생체 내에 현미경 종양 미세 환경에서 다세포 프로세스의 단일 셀 해상도 이미징 할 수 있습니다. 형광 표지 된 종양 세포, 대 식세포, 혈관 공간, 제 2 고조파 발생 신호를 이용하여 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화함으로써 종양 미세 환경에서 다수의 구획을 동시에 촬상 동안 추적. Dendra2 (도 1a)로 표지 유방 종양 세포, MMTV-PyMT-Dendra2 쥐에서 수행 된 형광 단백질 표지 된 종양 세포가 형질 전환 마우스에서 생성 될 수있다. ECFP으로 표시 식세포가 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 마우스 이러한 형질 전환 마우스를 횡단하여 종양 세포와 대 식세포 모두 MMTV-PyMT 마우스에 표시되어 있습니다. 종양 세포 및 대 식세포의 이중 표지 전략 두 세포 유형의 직접적인 상호 작용 (도 1a 실시간으로 시각화 될 수있다). 또한, GFP 형질 인간 유방암 세포주 또는 환자 유래의 종양 세포는 종양 세포를 라벨 할 수있다. 대 식세포는 식세포 대 식세포 (그림 1B)에 축적 형광 표지 된 70 kDa의 덱스 트란을 사용하여 표시 할 수 있습니다. 이러한 방법은 종양 세포 식세포 스트리밍 운동성, 혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation 동적 다세포 이벤트의 연구를 추진 하였다. 종양 혈관 투과성의 변화를 시각화하기 위해, 형광 표지 된 고 분자량 덱스 트란 (155 kDa의 이상은 9,13,21,22을 권장) 또는 양자점은 혈관 공간 (그림 1) 레이블을하는 데 사용됩니다. 155 kDa의 덱스 트란 또는 양자점들은 용이 interendothelial 공간 (23)을 통해 확산되지 않도록 충분히 크다.
연속 고해상도 영상은 혈관 투과성 및 이벤트 캡처 용이TMEM (그림 2, 영화 1)에서 덱스 트란 혈관 외 유출 및 통관의 역학의 정량화. 혈관 공간을 용이 (도 2의 '0)에서와 시간 경과 시퀀스의 개시에서 155 kDa의 덱스 트란에 의해 정의되기 때문에, 혈관 외 형광 덱스 트란이 경과 시퀀스의 각 프레임에서 정량화 할 수있다. (2) 및 영화 도표 155 kDa의 덱스 트란 - TMR이 MMTV-PyMT-Dendra2로 꼬리 정맥 카테터를 통해 주입의 한 혈관 외 유출을 보여; Csf1r - CFP 마우스입니다. Dendra2 표지 된 종양 세포 (녹색) 및 CFP 표지 된 대 식세포 (시안)가 살아있는 동물에서 TMEM를 식별하는 데 사용된다. 혈관 투과성의 사이트에서 TMEM 구조는 흰색 상자에 개략되어있다. 혈관 공간은 혈관 투과성의 이벤트 기간 동안 혈관 및 혈관 내용의 넘쳐 흐르는 시각화 155 kDa의 덱스 트란 - TMR (적색)으로 표시됩니다. 155 kDa의 덱스 트란 - TMR의 혈관 외 유출의 피크그림 2는 29 ', 34'사이에 볼 수있다. 혈관 외 덱스 트란은 155 kDa의 덱스 트란 - TMR의 채널을 보여주는 상단 패널에 흰색 화살표에서 하부 패널에 빨간색 화살표에서 볼 수있다. 155 kDa의 덱스 트란 - TMR은 조직에서 지우고 그림 2 '(97)에서 볼 수 있듯이 혈관 외 TMR 신호의 감소로 볼 수있다. ImageJ에 혈관 외 덱스 트란의 시간 경과 시퀀스의 편집 정량 후.
종양 미세 환경에 자발적 이벤트 관찰에 더하여, 상기 식별 현상의 기본 기작을 연구하는 것이 중요하다. 추가 혈관 염료 또는 혈관 투과성을 조절 시그널링 이벤트에 대한 통찰력을 제공 할 수있는, 혈관 투과성을 유도하는 단백질을 주입.도 3은 10 kDa의 덱스 트란-FITC (녹색) 및 155 kDa의 덱스 트란 - TMR (적색)의 혈관 외 유출의 차이를 보여준다.고 분자량 155 kDa의 덱스 트란 - TMR은 시간 경과 영상의 시작 직전에 투여된다. 다섯 Z-스택은 10 kDa의 덱스 트란-FITC를 주입하기 전에 기저선을 설정 시간 경과 순으로 획득된다. 5 번째 이후의 취득 화상 취득을 방해하지 않고 10 kDa의 덱스 트란 FITC 꼬리 정맥 카테터를 통해 투여되는 Z 스택. 155 kDa의 덱스 트란 - TMR이 혈관 공간 (그림 3, 0 '6')에 국한 유지하면서 덱스 트란-FITC는 즉시 혈관 외 유출로 혈관을 입력 볼 수있다. 10 kDa의 덱스 트란 FITC 완전히 혈관에서 extravasates 및 혈관 (56 '및 영화 2에서와 같이도 3)로 155 kDa의 덱스 트란 TMR 떠나는 조직으로부터 클리어한다. 주입하기 전의 시점을 이용하여 10 kDa의 덱스 트란-FITC의 혈관 외 유출의 동역학 용이 155 kDa의 덱스 트란 TMR (13)과 비교 될 수있다. 10 kDa의의 dextr의 즉각적인 혈관 외 유출주입 후-FITC는 혈관에서 155 kDa의 덱스 트란 - TMR의 보존 및 자연 혈관 투과성 이벤트 13에서 크게 다르다. 추가 실험 컨트롤은 내피 세포의 또는 VEGFA 165 - 매개 투자율 (13)을 통해 기계적 중단을 통해 혈관 투과성을 유도을 포함하여 수행 할 수 있습니다. 자발 투과성 이벤트 155 kDa의 덱스 트란 TMR의 혈관 외 유출의 동력학은 10 kDa의 덱스 트란, 및 종양 미세 혈관 투과성 이벤트와 관련된 이벤트 신호를 이해하는 혈관 투과성을 유도하는 다른 수단에 비교 될 수있다.
종양 미세 환경에서 세포와 혈관 라벨 그림 1. 전략. (A) Dendra2로 표지 종양 세포와 형질 전환 MMTV-PyMT 마우스 (MMTV-iCre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT)와 CFP으로 표시 식세포 (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). 종양 혈관은 꼬리 정맥 카테터에 의해 관리 155 kDa의 덱스 트란 - TMR으로 표시됩니다. (B) 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 양자점으로 표시 70 kDa의 덱스 트란 - 텍사스 빨간색으로 표시 식세포 및 혈관과 TN1-GFP 환자 유래의 이종 이식 종양. 스케일 바, 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 과도 혈관 투과성을 시각화. TMEM에서 155 kDa의 덱스 트란 - TMR (적색) 혈관 외 유출 및 종양 세포 intravasation의 (A) 생체 내에 현미경 (IVM) 시간 경과 (흰색 상자). Dendra2 (녹색, TC), ECFP와 대 식세포 (시안, M)와 BLO 표지 종양 세포155 kDa의 덱스 트란 - TMR (빨강, BV)와 OD 선박. 혈관 투과성 부위 (흰색 화살표). (B) 절연 155 kDa의 덱스 트란 - TMR 채널. 빨간색 화살표는 덱스 트란 혈관 외 유출 (흰색)를 표시합니다. 스케일 바, 50 μm의. 영화 1 시간 경과 현미경의 영화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 시각화 여러 형광 표지 된 덱스 트란. 155 kDa의 덱스 트란 - TMR (적색)과 10 kDa의 덱스 트란-FITC (녹색)의 혈관 외 유출의 차이의 IVM 시간 경과. 대 식세포는 ECFP (시안), 청색 (SHG)에서 콜라겐으로 표시됩니다. 혈관에 빨간색 155 kDa의 덱스 트란 - TMR의 오버레이 및 녹색 10 kDa의 덱스 트란-FITC는 노란색입니다. 녹색 10 kDa의 덱스 트란-FITC 피크의 신속한 혈관 외 유출은 6 분이다. SCAL전자 바, 50 μm의. 영화 2 시간 경과 현미경의 영화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시간 경과 IVM과 자연 일시적인 혈관 투과성을 떠올리 영화 1. Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT 표지 종양 세포와 유전자 변형 MMTV-PyMT 마우스 시각화 일시적인 혈관 투과성 (그림 2에서와 같이) 시간 경과 현미경 -Dendra2 / MMTV-PyMT) 및 CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP)으로 표시 식세포. 155 kDa의 덱스 트란 - TMR의 혈관 외 유출 (왼쪽 패널에서 레드, 화이트 오른쪽 패널)의 혈관 외 유출은 종양 혈관의 분기점에서 관찰된다. P임대이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
시간 경과 IVM 여러 형광 표지 된 덱스 트란의 혈관 외 유출을 시각화 영화 (2). 형질 전환에 155 kDa의 덱스 트란 - TMR (적색)과 10 kDa의 덱스 트란-FITC (녹색)의 혈관 외 유출의 (그림 3에서와 같이) 시간 경과 현미경 CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP)으로 표시 식세포와 MMTV-PyMT 마우스입니다. 콜라겐의 SHG은 파란색으로 표시됩니다. 녹색 10 kDa의 덱스 트란-FITC 빠르게 extravasates 및 혈관과 조직에서 지워 동안 레드 155 kDa의 덱스 트란 - TMR은 시간 경과 기간 동안 종양 혈관에 남아 있습니다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
종양 미세 환경에서 자연적으로 발생하는 세포 상호 작용은 종양 세포 운동성 및 intravasation 변화로 이어질 수있다. 살아있는 종양 조직의 고해상도 생체 내에 촬상 매우 과도 10,13,24 될 수 다세포 역학의 시각화를 허용한다. 종양 미세 환경에서 프로세스의 분자 메커니즘에 필수적인 정보를 제공 할 수 있습니다 이산 시점으로 얻은 생체 내 분석 또는 시간 경과 이미지의 최종 점. 생체 내에 영상화 연구 약물 치료 25 내지 30에 혈관 신생, 종양 세포 이동 및 응답에 대한 새로운 통계를 생성 며칠 동안 발생하는 종양 미세 환경에서 처리를 연구하는 데 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석 인해 프로세스의 시간 스케일로 종양 미세 환경에서 과도 이벤트의 동력학을 캡처 할 수는 7,31 공부된다. 일정한 과정에서 여러 일시적인 이벤트를 구별하는 것은 의미있는 광고입니다생체 내에 현미경의 유리한.
이 프로토콜에 기재된 생체 내에 이미징 기술은 여러 세포 계통과 구조의 형광 표지에 의한 종양 미세 환경에서 세포 역학의 직접적인 시각화를 가능하게한다. 광자 현미경은 정기적으로 (24)를 수행 한 300 μm의 깊이와 단일 광자 공 초점 현미경을 통해 이미지의 큰 깊이를 허용합니다. (50)의 Z-스택 수집 - 2 ㎛의 단계 100 μm의는 종양 미세 환경의 서로 13 및 혈관 구조 향해 연장으로 세포하게 돌기부를 포함한 세포 상호 작용의 3D 재구성을 생성하도록 충분히 높은 해상도이다. 시간 경과 이미지 시퀀스에서 영화 및 3D 재구성은 주사 염료, 혈관 투과성의 형광 신호 강도의 변화를 이용하여, 세포 운동 (속도와 방향성)의 정량이 가능합니다.
SP를 캡처하기 위해,ontaneous 셀룰러 이벤트는 하나의 시퀀스로 촬영 된 개별 이미지의 수는 이벤트의 동력학을 캡처 화상 취득의 비율을 허용하도록 최적화되어야하지만 또한 동안 개별 이벤트를 캡처 할 가능성을 증가시키기에 충분한 물리적 공간을 커버 하나의 시간 경과 순서. 고려해야 할 공간 촬상 파라미터 등; A ~ Z 스택에서 조각의 수, 획득 한 Z-스택 및 Z-스택의 개별 조각 사이의 축 방향 거리와보기의 필드의 수. 따라서, 화상 취득을 시작하기 전에 이러한 파라미터들을 설정하는 프로토콜의 중요한 단계이다. 광자 현미경을 사용하여, Z 시리즈에서 30 프레임 (500 μm의 X 500 μm의)의 인수는 약 60 초입니다. 관찰 된 종양 세포 intravasation의 기간 intravasation의 3D 재구성 여러 Z-스택 캡처 13 분 정도일 수있다 때문에, Z 스택의 획득 시간 t가 제한되었다60 초 오. 따라서, Z - 스택의 최대 30 조각보기의 단일 필드 획득했다. 세포의 3D 재구성이 요구되었다 때문에, Z-슬라이스 사이의 축선 단계는, 2㎛로 하였다. 이는 3D 재구성 수 있도록 세포 볼륨에 충분한 정보 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 연구되고 라이브 이벤트의 역학을 기반으로 사용되는 현미경 및 이미징 소프트웨어를 최적화해야합니다.
현미경 스테이지와 꼬리 정맥 IV 카테터의 고무 패드의 변경은 모두 촬상 시간의 상당한 증가를 위해 사용할 수있다. 유리 커버 슬립에 XY 드리프트를 최소화하면서 고무 패드 형태는 잘 종양의 유지 수화를 허용합니다. PBS의 투여와 함께 상기 가열 챔버의 조합은 수화 및 동물의 생체의 온도를 유지한다. 혈관 혈류와 혈액의 흐름을 유지하는 조합이 조건은, 종양 세포에서 VAS 이벤트 연장 이미징 있도록혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation 포함 culature.
이 기술의 한계는 종양 미세 환경에서 세포를 시각화하기 위해 사용할 수있는 형광 라벨의 개수이다. 형광 단백질을 포함하는 추가 세포 유형 (예, 내피 세포, 섬유 아세포 또는 혈관 주위 세포)에 형질 전환 마우스를 생성하는 것은 어렵고 시간이 소요될 수 있습니다. 그러나, 미래의 응용 가능성은 이식 종양 세포 및 대 식세포의 70 kDa의 덱스 트란 라벨링 간질 세포 유형의 형광 단백질 표지의 조합을 이용할 수있다. 트랜스 제닉 마우스를 라벨이 전략의 조합을 이용하여 건너 셀룰러 라벨 새로운 조합 종양 미세 환경 셀룰러 이동 이벤트를 평가하기 위해 생성 될 수있다.
면역 형광 염색법에 기초하여 종점 실험 달리 고해상도 현미경 생체 내에 자발적인 및 과도의 시각화를 허용종양 미세 환경의 이벤트. 여기에 설명 된 생체 내에 촬상 절차는 새로운 이벤트와 정지 화상으로부터 해독 될 수없는 종양 미세 환경에서 세포의 상호 작용을 보여준다. 상호 작용하는 세포의 종류 나 프로세스, 이러한 이벤트의 동역학에 새로운 정보를 사용하여 가설이 상호 작용을 구동하는 신호 전달 경로를 조사하기 위해 생성 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 보너스 번호 (ASH, W81XWH-13-1-0010)에서 국방부의 유방암 연구 프로그램, NIH CA100324, PPG CA100324 및 통합 이미징 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
