Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.
Introduction
הפצת תאים סרטניים מגידול החלב הראשוני הוכחה לערב תאים סרטניים רק לא, אבל לארח תאי סטרומה כוללים מקרופאגים ותאי האנדותל. יתר על כן, בכלי הדם של הגידול הוא לא נורמלי עם חדירות מוגברת 1. לפיכך, קביעת האופן שבו תאים סרטניים, מקרופאגים ותאי האנדותל אינטראקציה לתווך חדירות כלי הדם ואת intravasation תאים סרטניים ב במיקרו-סביבה של הגידול הראשוני הוא חשוב עבור גרורות הבנה. הבנת קינטיקה של חדירות כלי דם, intravasation תאים סרטניים ואת מנגנון האיתות הבסיסי של אינטראקציות רבות-תאי ב microenvironment הגידול יכול לספק מידע חיוני בדבר ההתפתחות והמנהל של טיפולים אנטי סרטניים.
האמצעי העיקרי של לימוד חדירות כלי הדם הגידול in vivo כבר למדידת צבעים extravascular כגון אוונס 2 כחול, dextrans משקל מולקולרי גבוה (155 KDA)3 ו fluorophore או חלבונים מצומדות radiotracer (כולל אלבומין) 4 בנקודות זמן קבוע לאחר ההזרקה של צבע. התקדמויות מיקרוסקופיה, במודלים של בעלי חיים ו צבעי ניאון אפשרו הדמיה של תהליכים תאיים ו חדירות כלי הדם בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ intravital 5.
הדמיה חייה עם רכישת תמונות סטטיות, או רצפי זמן לשגות קצר על מספר נקודות זמן אינה מאפשרת ההבנה המלאה של אירועים דינמיים במייקרו-הסביבה של גידול 6,7. אכן, רכישת תמונה סטטית במשך 24 שעות הראו כי בכלי הדם של הגידול הוא דולף, אולם הדינמיקה של חדירות כלי הדם לא נצפתה 6. לפיכך, זמן לשגות הדמיה רציפה המורחבת עד 12 שעות לוכדת את קינטיקה של אירועים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש multiphot זמן לשגות המורחבתעל מיקרוסקופיה intravital ללמוד אירועים רב-תאיים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול. סוגי תאים מרובים במיקרו-סביבה של הגידול מסומנים עם צבעי בזריקות או באמצעות חיות טרנסגניות להביע חלבוני ניאון. באמצעות קטטר וריד זנב צבעי כלי דם או חלבונים ניתן להזריק לאחר תחילת הדמיה לרכוש נתונים הקינטית של אירועים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. עבור הדמית תא חי גידול החלב חשוף תוך הכנת הכירורגית של דש עור. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד צינורות מכפיל מרובים (PMT) גלאי 8. באמצעות מסננים מתאימים, אלגוריתם חיסור מאפשרת 4 גלאי PMT לרכוש 5 אותות ניאון במיקרו-סביבה של הגידול בו זמנית 9. מיקרוסקופיה intravital multiphoton ברזולוציה גבוהה לוכדת הדמיה ברזולוציה תא בודד של אינטראקציות גידולים stroma ב במיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל טוב understanding של חדירות כלי הדם תאים סרטניים intravasation 10-13. באופן ספציפי, חשף הדמית intravital מורחב מקומי מאוד, אירועים חדירים כלי דם חולפים המתרחשים באופן סלקטיבי באתרים של אינטראקציה בין תאים סרטניים, מקרופאג ו תא האנדותל (מוגדר כגידול microenvironment של גרורה, TMEM 14) 13. יתר על כן, intravasation תאים סרטניים מתרחש רק TMEM והוא במרחב ובזמן בקורלציה עם חדירות כלי דם 13. ברזולוציה תא בודד של הדינמיקה של האירועים הללו התאפשרה באמצעות מיקרוסקופיה multiphoton זמן לשגות המורחבת של תאים שכותרתו fluorescently ב במיקרו-סביבה של הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי ע"ש אלברט איינשטיין טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואה ועדת שימוש.
1. גידולים יצירת שכותרתו fluorescently ו המקרופאגים גידולים הקשורים
- צור תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ידי חציית מודל סרטן שד הספונטני, קדומות, מהונדסים גנטיים עכבר שבו חוזר מסוף ארוך וירוס גידול עכבר החלב שמניע את אנטיגן T באמצע polyoma (MMTV-PyMT) עם עכברים טרנסגניים עם כתבי ניאון [כלומר, פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (EGFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת (ECFP) או Dendra2] 8,9.
- מקרופאגים תווית fluorescently בחיות PyMT עם שכותרתו fluorescently תאים סרטניים על ידי חציית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית עם כתבים ניאון ספציפיים myeloid- ו macrophage- [כלומר, MacGreen 15 או עכברים MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP 16].
- לחילופין, ליצור שכותרתו fluorescently גידולים באמצעות השתלת orthotopic של שכותרתו fluorescently תאים PyMT הגידול (syngeneic), שורות תאי סרטן שד אנושיים או גידולים שמקורם בחולה אדם מן המעלה הראשונה (xenografts) 11,17.
- שתל fluorescently שכותרתו תאי PyMT גידול לעכברי syngeneic עם תאי מיאלואידית ניאון שכותרתו חלבון כדי ליצור חיות עם תאים סרטניים ותאים מיאלואידית שכותרתו fluorescently 13.
- להזריק 100 μl של 10 מ"ג / 70 dextran kDa פלורסנט ק"ג ידי וריד הזנב תוך ורידי (iv) לתוך כשל חיסוני חמור עכברים (SCID) עם גידולים xenograft של שורות תאים אנושיים או גידולים ראשוניים הנגזרות למטופל מקרופאגים תווית fluorescently 2 hr לפני תחילת של הדמיה intravital.
התקנת מיקרוסקופ 2. הכנת ההדמיה
הערה: הליך זה מתאר את ההגדרההדמיה intravital על מיקרוסקופ multiphoton 8.
- הפעל את כל מרכיבי מיקרוסקופ ליזר כולל לייזרי שני פוטונים ואת הגלאי.
- הפעל את תיבת חימום עד 30 מעלות צלזיוס מראש לחמם את הבמה. שלב זה הוא קריטי לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של החיה.
- לשימוש על מקום מיקרוסקופ הפוך להכניס בשלב מחוייט על במת מיקרוסקופ. את כנס המנהג הוא גיליון 1/8 "אלומיניום עבה במכונה כדי להתאים את החלל הבימתי הכנס ועם 1" קוטר דרך חור במרכז הדמיה.
- נגב את במת מיקרוסקופ כנס במה עם 70% אתנול ו אוויר יבש.
- מניחים ירידה גדולה של מים על המטרה מיקרוסקופ NA 20X, 1.05 לשמור על קשר אופטי עם מכסה זכוכית.
- זכוכית מכסה מקום (# 1.5 עובי) מעל נמל ההדמיה על להכניס במת מיקרוסקופ. Secure במקום עם קלטת מעבדה.
- השתמש ניקוב חורים אגרוף חור 2 ס"מ X 2 ס"מב רפידת גומי גמישה למקם את רפידת הגומי על הבמה מיקרוסקופ עם חור הכרית מיושרת עם החור להכניס בשלב המותאם אישית.
3. הכנת זנב וריד צנתר ריאגנטים עבור הזרקה במהלך הדמיה
- חותכים באורך 30 ס"מ פוליאתילן צינורות (PE).
- בעזרת מלקחיים, להזיז את המחט מתכת של מחט 31 G הלוך ושוב עד שהוא קוטע את דבריו של פלסטיק חלק חיבור לצנרת.
- בעזרת מלקחיים, הכנס את הקצה הקהה של המחט מנותקת לתוך צינורות PE.
- הכנס מחט 31 G אל הקצה השני של צינור PE.
- ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם בופר פוספט סטרילית (PBS) ולהכניס אותו לתוך 31 המחט G ולשטוף את כל האוויר מתוך צינור ומחט עם PBS. PBS משמש לשמירה הידרציה osmolarity דם 9,18, לעומת זאת סליין איזוטוני יכול לשמש גם.
- ממלאים מזרק 1 סמ"ק עם 200 μl של 3 מ"ג / ק"ג 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) או נקודות קוונטיות עבור תיוג כלי דם.
- הכן כל החלבונים בזריקות אחרות כגון איזופורם חומצה 165 אמינו של גורם (vascular endothelial growth VEGFA 165) בתוך מזרק 1 סמ"ק ומניחים על קרח. להזריק 0.2 מ"ג / ק"ג VEGFA 165 19 בריכוז של 0.05 מ"ג / מ"ל.
קלטי 4. זנב שכינת צנתר וריד
- מניחים את החיה תחת הרדמה באמצעות חדר אינדוקציה עם isoflurane 5% עם O 2 כגז המוביל.
- מעביר את העכבר על הפלטפורמה כירורגית לכשזו בהרדמה מלאה ולא מגיבה קמצוץ בוהן.
- קו ההרדמה להרחיב isoflurane לפלטפורמה כירורגית, לסגור את קו ההרדמה לתא האינדוקציה ומקום חרטומו על החוטם של החיה. מנמיכים את isoflurane בין 5% ל -2.5%.
- החל משחת עיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
- מחממים את החיה תחת מנורת חימוםעבור 2 דקות נוספות כדי להגביר את זרימת הדם בזנב כתפוצה מאטה עם הרדמה עמוקה.
- לעקר וריד הזנב העכבר עם 70% אתנול.
- הכנס את קצה המחט 31 G מן קטטר נבנה בסעיף 3 לווריד הזנב לרוחב של החיה ודחוף את מחט 2-3 מ"מ.
- משוך את הבוכנה לראות דם, להבטיח את הקטטר ממוקם וריד הזנב.
- השתמש אורך 1 סנטימטר של קלטת המעבדה הניחה על המחט להחזיק את המחט במקביל מקום הווריד לאורך הזנב.
5. עור דש הליך כירורגי כדי לחשוף את גידול החלב
- עם החיה על הפלטפורמה כירורגית ספוגית הגידול ואת משטח הגחון עם אתנול 70%. הערה: כפי שתואר, הליך זה לא מבוצע לחלוטין בסביבה נקייה מחיידקים. הפעלות הדמיה ארוכות שבו זיהום יכול להיות גורם בלבול, מומלץ להשתמש בטכניקה מזוהמת נכונה.
- שימוש Steriמלקחיים le, להרים את העור הגחון במספריים סטריליות לעשות חתך תת עורי לאורך קו האמצע הגחון כ 1 ס"מ אורך. הימנע ניקוב הצפק במהלך החתך.
- בעדינות לחתוך את רקמת חיבור הצמדת בלוטת החלב ואת הגידול הרחק הצפק לחשוף את גידול החלב.
- בעזרת מספריים מלקחיים, להסיר בעדינות וחתך את fascia ושומן מן השטח החיצוני של הגידול תוך שמירה על שלמות כלי הדם הגידול ומזעור דימום. שלב זה הוא קריטי בשמירה על אדריכלות גידול בכלי דם אספקת הגידול.
6. הכנת בעלי חיים למיקרוסקופיה
- מעביר את החיה על במת ההדמיה המחוממת מראש עם הגידול החשוף דגש על coverslip על להכניס הבמה מעל המטרה מיקרוסקופ הדמיה. תשמור על עצמך כדי להעביר את הקטטר זנב וריד בעדינות עם החיה כדי לא לסלק את המחט.
- ה מקוםחרטומו דואר הרדמה על החוטם של החיה לשמור סט הרדמת isoflurane 3%.
- מקם את החיה כך שהגידול נח החור של כרית הגומי יוצר קשר עם coverslip הזכוכית.
- השתמש בשתי כריות גומי כדי להחזיק את הגידול בעדינות במקום ולתקן אותם הבמה מיקרוסקופ עם קלטת מעבדה להפחית תנועה במהלך רכישת תמונה.
- ממלא את החדר מפנקס הגומי עם PBS כדי לשמור על רקמת hydrated ולשמור על קשר אופטי עם coverslip.
- התחל מעקב אחר הסימנים החיוניים של החיה עם בדיקת oximeter הדופק. צרף חיישן קליפ לירך של החיה. לחלופין צווארון כי הוא מוגדר כך שיתאים סביב הצוואר יכול לשמש.
- מניחים את תיבת חימום על החיה לשמור 30 ° C 20.
- לאט להפחית את רמת isoflurane ל 0.5-1% כדי לשמור על הרדמה לשמור על זרימת הדם.
7. תמונה רכישה הזרקת Fluorescצבעי ent וחלבונים בזריקות
- באמצעות המוקד העיני מיקרוסקופ על התאים סרטני ניאון על פני השטח של הגידול.
- בחר שטח של ריבית על ידי מציאה באזורים עם זורם כלי דם. הבחירה של תחום העניין עם כלי דם זורמים היא קריטית להערכת בכלי דם של גידול.
- לאחר באזור של עניין נבחר להחליף את המיקרוסקופ למצב ההדמיה multiphoton.
- הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של סדרת z. קבע את הגבול העליון של z-series באמצעות שמאי המוקד להעביר את המטרה למיקום ההתחלה הרצוי ולחיצה על מצבה Z "למעלה" כפתור. קבע את הגבול העליון של z-הסדרה על ידי הדמית רשת הסיבים קולגן על פני השטח של הגידול בדור הרמוני השני (SHG) הערוץ וההתבוננות כשאף תאים אבל רק סיב קולגן גלויים.
- הגדר את הגבול התחתון של z-סדרה על ידי הזזת המטרה לעומק הדמיה הרצוי (typically 50 - 150 מיקרומטר) ולחיצה על מיקום Z "תחתי" כפתור.
- הגדר את גודל הצעד ידי הקלדת הערך הרצוי בשדה גודל הצעד. לקבוע צעד גודל מבוסס על שיקולים לפתרון וזמן רכישה (בדרך כלל 2 מיקרומטר משמש לשיקום 3D ברזולוציה גבוהה 5 מיקרומטר אחר).
- הגדר את מרווח זמן לשגות על ידי מעבר ללוח Time-lapse והזנת זמן לשגות הרצוי לתחום זמן לשגות. לקבלת החלטה זמנית אופטימלית להגדיר את מרווח הזמן 0 שניות הדמיה רציפה. הערה: הזמן לשגות הדמיה ארוכה מומלץ להגדיר את פרק הזמן עד 10 שניות בין רכישות כדי לחדש את נוזל הטבילה האובייקטיבי.
- לאחר הפרמטרים הדמיה נקבעו, להזריק לאט 155 kDa dextran-TMR.
- הסר את המזרק עם PBS הקטטר זנב וריד ולהחליף עם מזרק המכיל מטפלת 155 kDa dextran-TMR לא להכניס שום בועות לתוך line.
- לאט לאט להזריק 155 kDa dextran-TMR לעכבר, עם עוצמת קול גבוהה יותר של 200 μl, ולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS. שלב קריטי: בצע את הזריקה לאט לנקוט באמצעי זהירות כדי להימנע מקבלת פתרון מחוץ הווריד.
- הפעל את רכישת זמן לשגות הדמיה Z- מחסנית על ידי לחיצה על Z-Stack וכפתורים זמן לשגות לדכא אותם ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההקלטה.
- אם dextrans ניאון האחר, כלומר, 10 kDa dextran-והעמסת isothiocyanate (FITC), או חלבונים, כלומר, VEGFA 165, נערך מראש, להזריק אותם לאחר תחילת רכישת תמונה ב = 0 התחלה דקה.
- הסר את המזרק עם PBS ב קטטר וריד הזנב ולהחליף עם מזרק המכיל 10 kDa dextran-FITC או VEGFA 165 נזהרת שלא להציג את כל בועות לתוך קו.
- לאט לאט להזריק הזרקה לתוך העכבר באמצעות קטטר וריד הזנבולהחליף את המזרק עם מזרק המכיל PBS.
- כל 30-45 דקות, להזריק לאט 50 μl של PBS או תמיסת מלח כדי לשמור על לחות של החיה.
8. המתת חסד
- עם סיום רכישת התמונה, להרדימו.
- הגדל את isoflurane עד 5%.
- שמור את החיה תחת isoflurane 5% עד 30 שניות לאחר שתפסיק לנשום ולהסיר את החיה מן הבמה.
- בצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוחלט.
עיבוד תמונה 9.
- לרכוש תמונות קבצי TIFF 16 סיביות לכל ערוץ הפרט בכל נקודת זמן ולשמור ברצף.
- בצע הפרדת חפיפה ספקטרלית (כלומר, ה- GFP ו CFP), חיסול של סחיפה XY והדור של סרטים מתוך רצפי זמן לשגות בשיטות הוקמה בשנת ImageJ 9. בצע שחזורי משטח 3D של תמונות ברזולוציה גבוהה 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופיה intravital הזמן לשגות מורחבת מאפשרת הדמיה ברזולוצית תא בודדת של תהליכים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. על ידי תאים סרטניים תיוג פלורסנטי, מקרופאגים, המרחב וסקולרית, באופן חזותי רשת סיבים קולגן באמצעות האות דור הרמונית השני, מספר תאים ב במיקרו-סביבה של הגידול מתבצע המעקב אחר בו זמנית במהלך ההדמיה. תאים סרטניים שכותרתו עם חלבוני ניאון יכול להיות שנוצר בעכברים טרנסגניים כפי שנעשה בעכברים MMTV-PyMT-Dendra2, עם תאים סרטניים החלב שכותרתו עם Dendra2 (איור 1 א). על ידי חציית עכברים טרנסגניים אלה עם Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP עכברים, אשר יש מקרופאגים שכותרתו עם ECFP, הן בתאי גידול מקרופאגים מסומנים העכברים MMTV-PyMT. בעזרת אסטרטגיית תיוג כפול של תאים סרטניים מקרופאגים, האינטראקציה הישירה של שני סוגי התאים ניתן דמיינו בזמן אמת (איור 1 א '). בנוסף, קווי תאי סרטן שד אנושיים או תאים סרטניים שמקורם בחולה transduced עם GFP ניתן להשתמש בתווית תאים סרטניים. יכול להיות מתויג המקרופאגים באמצעות שכותרתו fluorescently 70 dextran kDa אשר נערם מקרופאגים phagocytic (איור 1B). שיטות אלה קדמו את המחקר של אירועים רבים-תאיים דינמיים כגון תנועתיות הזרמת תא-מקרופאג גידול, חדירות כלי דם ואת intravasation תאים סרטניים. כדי לחזות שינויים בחדירות כלי הדם הגידול, dextran משקל מולקולרי גבוה שכותרתו fluorescently (155 kDa ומעלה מומלץ 9,13,21,22) או נקודות קוונטיות משמשים לתייג את החלל וסקולרית (איור 1). 155 נקודות dextran או קוונטי kDa הן גדולות מספיק שהם לא מפוזר בקלות דרך חללי interendothelial 23.
הדמיה ברזולוציה גבוהה רציפה מקלה על לכידת אירועי חדירות כלי דם ואתכימות של קינטיקה של extravasation ופינוי dextran ב TMEM (איור 2 ו סרט 1). היות והמקום וסקולרית מוגדר בקלות על ידי 155 dextran kDa ב חניכה של רצף זמן לשגות (כמו 0 'של איור 2) dextran ניאון extravascular ניתן לכמת בכל מסגרת של רצף זמן לשגות. איור 2 ו- Movie 1 להדגים את extravasation של 155 kDa dextran-TMR מוזרק דרך קטטר וריד הזנב לתוך MMTV-PyMT-Dendra2; עכבר Csf1r-CFP. תאים סרטניים שכותרתו Dendra2 (ירוק) מקרופאגים שכותרתו CFP (ציאן) ומשמשים לזיהוי TMEM בבעלי חיים. מבנה TMEM באתר של חדירות כלי דם מתואר קופסא לבנה. החלל וסקולרית מסומן עם 155 kDa dextran-TMR (אדום) כדי לחזות זורם בכלי הדם ואת extravasation של תוכן וסקולרית במהלך אירועי חדירות כלי הדם. השיא של 155 kDa dextran-TMR extravasationבאיור 2 נתפסים בין 29 'ו -34'. dextran extravascular נתפס על ראש החץ הלבן לוחות העליונים ובבית החץ האדום ב הפנלים התחתונים, מראה את הערוץ יחיד של kDa 155 dextran-TMR. 155 kDa dextran-TMR מנקה מהרקמה ומתייחס אליו כאל ירידת אות TMR extravascular כפי שניתן לראות ב 97 'באיור 2. אחרי העבודה על הכנת רצף הזמן לשגות ב dextran extravascular ImageJ היא לכמת.
בנוסף התבוננות אירועים ספונטניים במיקרו-סביבה של הגידול, חשוב ללמוד את המנגנון המולקולרי שבבסיס התופעות מזוהה. הזרקת צבעים וסקולרית נוספים או חלבונים כדי לגרום חדירות כלי הדם יכול לספק תובנות לגבי האירועים איתות ויסות חדירות כלי הדם. איור 3 מדגים את ההבדל extravasation של 10 kDa dextran-FITC (ירוק) ו -155 kDa dextran-TMR (אדום).גבוהה מולקולרית משקל 155 kDa dextran-TMR מנוהל מיד לפני תחילת זמן לשגות הדמיה. חמש Z- ערימות נרכשות ברצף הזמן לשגות לקבוע בסיס לפני 10 kDa dextran-FITC מוזרק. לאחר הרכישה של 5 th Z-לערום את 10 kDa dextran-FITC מנוהל באמצעות קטטר וריד הזנב, בלי להפריע רכישת התמונה. Dextran-FITC נתפסת הזנת בכלי הדם עם extravasation מיידית תוך 155 kDa dextran-TMR נותרת מוגבלת לשטח וסקולרית (איור 3, 0 'ו -6). 10 kDa dextran-FITC extravasates לחלוטין את כלי הדם ומנקה מרקמות עוזב את 155 kDa dextran-TMR בתוך כלי הדם (איור 3 כפי שניתן לראות ב -56 'ו- Movie 2). באמצעות נקודת זמן מלפני ההזרקה, קינטיקה של 10 kDa extravasation dextran-FITC ניתן להשוות בקלות 155 kDa dextran-TMR 13. Extravasation המיידית של 10 kDa dextrAN-FITC לאחר ההזרקה שונה באופן מהותי מן השמירה של 155 kDa dextran-TMR בכלי הדם ואת האירועים חדירות כלי הדם ספונטנית 13. שולט ניסיוני נוסף יכול להתבצע כולל גרימת חדירות כלי דם דרך ההפרעה המכאנית של האנדותל או דרך 165 VEGFA בתיווך חדיר 13. קינטיקה של extravasation של 155 kDa dextran-TMR של אירועים חדירות ספונטנית ניתן להשוות 10 dextran kDa, ואמצעים אחרים של גרימת חדירות כלי הדם כדי להבין את האירועים ואותות מעורבים באירועים חדירות כלי הדם במיקרו-סביבה של הגידול.
אסטרטגיות באיור 1. תיוג התאים ואת כלי הדם ב microenvironment הגידול. (א) מהונדס עכבר MMTV-PyMT עם תאים סרטניים שכותרתו עם Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) מקרופאגים שכותרתו עם CFP (Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP). בכלי הדם של הגידול מסומן עם 155 kDa dextran-TMR מנוהל על ידי קטטר וריד הזנב. (ב) גידולי xenograft נגזרות חולה TN1-GFP עם מקרופאגים שכותרתו עם 70 kDa dextran-טקסס האדומה כלי דם שכותרתו עם נקודות קוונטיות באמצעות קטטר זנב הווריד. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. חזותי חדירות כלי הדם חולף. (א) מיקרוסקופיה Intravital (IVM) זמן לשגות של 155 kDa dextran-TMR (אדום) intravasation תא extravasation ו הגידול ב TMEM (קופסה לבנה). תאים סרטניים שכותרתו עם Dendra2 (ירוק, TC), מקרופאגים עם ECFP (ציאן, ז) ו bloכלי od עם 155 kDa dextran-TMR (אדום, BV). כלי דם באתרי חדירות (חץ לבן). (ב) מבודדים 155 ערוץ dextran-TMR kDa. החיצים האדומים מסמנים extravasation dextran (לבן). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. סרט של מיקרוסקופיה זמן לשגות ב סרט 1. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
חזותי איור 3. שכותרתו fluorescently dextrans מרובים. IVM זמן לשגות הבדל extravasation של 155 kDa dextran-TMR (אדום) ו -10 kDa dextran-FITC (ירוק). המקרופאגים מסומנים עם ECFP (ציאן) וקולגן בכחול (SHG). שכבת-העל של 155 אדום kDa dextran-TMR וירוק 10 kDa dextran-FITC בכלי הדם הוא צהוב. extravasation המהירה של 10 שיא dextran-FITC kDa הירוק נמצאת במרחק של 6 דקות. sCALדואר הבר, 50 מיקרומטר. סרט של מיקרוסקופיה זמן לשגות ב Movie 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. הדמיה חדירות כלי הדם חולף ספונטנית עם IVM זמן לשגות. מיקרוסקופיה זמן לשגות (כפי שניתן לראות באיור 2) של חדירות כלי הדם חולף דמיינו עכבר MMTV-PyMT מהונדס עם תאים סרטניים שכותרתו עם Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) מקרופאגים שכותרתו עם CFP (Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP). Extravasation של extravasation 155 kDa dextran-TMR (אדום בחלונית השמאלית, הפאנל הימני לבן) הוא ציין בנקודת סניף של כלי הדם של הגידול. Pלחכור לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרט 2. חזותי extravasation של dextrans מרובות שכותרתו fluorescently ידי IVM זמן לשגות. מיקרוסקופיה זמן לשגות (כפי שניתן לראות באיור 3) של extravasation של 155 kDa dextran-TMR (אדום) ו -10 kDa dextran-FITC (ירוק) בתוך מהונדס MMTV-PyMT העכבר עם מקרופאגים שכותרתו עם CFP (Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP). SHG של קולגן מסומן בכחול. האדום 155 kDa dextran-TMR נשאר בכלי הדם של הגידול למשך של זמן לשגות בעוד 10-FITC dextran ירוק kDa extravasates במהירות מנקה מכלי הדם לבין רקמות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינטראקציות הסלולר המתרחשות באופן ספונטני במיקרו-סביבה של הגידול יכול להביא לשינויים תנועתיות התא הגידול intravasation. הדמית intravital ברזולוציה גבוהה של רקמת גידול חייה מאפשרת ההדמיה של דינמיקה רבה תאית שיכול להיות 10,13,24 חולף מאוד. סוף-טעם מבחני vivo או זמן לשגות תמונות רכשה עם נקודות בזמן בדיד יכול לספק מידע חיוני על המנגנונים המולקולריים של תהליכים במיקרו-סביבה של הגידול. בדיקות הדמיה Intravital שימשו ללמוד תהליכים במיקרו-סביבה של הגידול המתרחשות על פני כמה ימים, לייצר תובנות חדשות על אנגיוגנזה, נדידת תאים סרטניים בתגובה טיפול תרופתי 25-30. עם זאת, מבחנים אלה אולי לא ללכוד את קינטיקה של אירועים חולפים במייקרו-הסביבה של הגידול בשל ממדי הזמן של תהליכים הנלמד 7,31. הבחנת אירועים חולפים מרובים מתהליכים מתמידים היא מודעת משמעותיתצפית של מיקרוסקופיה intravital.
טכניקת דימות intravital המתוארת פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ישירה של דינמיקה סלולר במיקרו-סביבה של הגידול על ידי תיוג הקרינה של שושלות ומבנים תאים מרובים. Multiphoton מיקרוסקופ מתיר יותר עומק הדמיה על מיקרוסקופ confocal פוטון יחיד עם מעמקי 300 מיקרומטר מבוצעים באופן רצוף 24. רכישת Z-ערימות של 50 - 100 מיקרומטר עם 2 מיקרומטר הצעדים האלה של ברזולוציה גבוהה מספיק כדי ליצור שחזור 3D של אינטראקציות הסלולר, כולל בליטות שתאי לעשות כפי שהם להאריך כלפי כל המבנים 13 וכלי דם אחרות במיקרו-סביבה של הגידול. סרטים 3D שחזורים מתוך רצפי זמן לשגות התמונה מאפשרים לכמת את תנועתיות הסלולר (מהירות כיווניות), באמצעות שינויים בעוצמת אות הניאון של צבעים להזרקה, חדירות כלי הדם.
על מנת ללכוד spאירועים הסלולר ontaneous מספר תמונות בודדות שנתפסו ברצף יחיד חייבים להיות מותאמים על מנת לאפשר קצב רכישה של תמונה הלוכד את קינטיקה של האירוע, אבל זה גם מכסה שטח גופני מספק כדי להגדיל את ההסתברות של לכידת כל אירוע בודד במהלך רצף זמן לשגות יחיד. פרמטרי ההדמיה מרחבית כי צריך להילקח בחשבון כוללים; מספר הפרוסות בערימה-Z, מספר שדות מבט עם Z- ערימות רכש והמרחק הצירי בין פרוסות בודדות בתוך מחסנית Z. לכן, קביעת פרמטרים אלה לפני תחילת רכישת תמונה הוא שלב קריטי בפרוטוקול. באמצעות מיקרוסקופ multiphoton, רכישת 30 מסגרות (500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר) בסדרת z-הוא כ 60 שניות. מאז משך intravasation תאים סרטניים הנצפה יכול להיות בסדר גודל של דקות 13, לכיד כמה Z-ערימות לשיקום 3D של intravasation, בפעם רכישת מחסנית Z הוגבלה to 60 שניות. לכן, שדה אחד של נוף עם עד 30 פרוסות בתוך מחסנית Z נרכש. יתר על כן, מאז השחזור של תאי 3D היה רצוי, הצעד הצירי בין Z-פרוסות נקבע ל 2 מיקרומטר. זה מאפשר מידע מספיק על כרכי תא כדי לאפשר שחזור 3D. פרמטרים אלו חייבים להיות מותאמים עבור כל תוכנת מיקרוסקופ הדמיה בשימוש מבוסס על קינטיקה של אירועי חיים נלמדים.
השינוי של רפידת הגומי על במת מיקרוסקופ ואת קטטר iv זנב הווריד אפשר הוא להגברה משמעותית בזמן הדמיה. טפסי רפידת גומי באר כדי לאפשר הידרציה מתוחזקים של הגידול תוך מזעור להיסחף XY על coverslip הזכוכית. השילוב של תא החימום עם הממשל של PBS שומר לחות וטמפרטורה פיזיולוגית של בעלי חיים. תנאים אלה בשילוב לשמור זלוף כלי הדם ואת זרימת הדם כדי לאפשר הדמיה המורחבת של אירועים הסלולר בבית vas הגידולculature כולל חדירות כלי הדם intravasation תאים סרטניים.
הגבלה של הטכניקה הזו הוא מספר תוויות ניאון שיכול לשמש כדי לחזות תאים במיקרו-סביבה של הגידול. יצירת עכברים טרנסגניים עם סוגי תאים נוספים (כלומר, תאי אנדותל, פיברובלסטים או pericytes) המכילים חלבון פלואורסצנטי יכולה להיות קשה זמן רב. עם זאת, יישומים פוטנציאליים בעתיד יכולים לנצל שילוב של תיוג חלבון פלואורסצנטי של סוגי תאי סטרומה עם תאים סרטניים מושתלים ו -70 תיוג dextran kDa של מקרופאגים. באמצעות שילוב של אסטרטגיות תיוג אלה וחציית עכברים מהונדס שילובים חדשים של תוויות הסלולר יכול להיווצר להעריך התנועה הסלולר ואירועים במיקרו-סביבה של הגידול.
בניגוד לניסויים נקודת הסיום מבוסס על מכתים immunofluorescence, מיקרוסקופיה intravital ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של ספונטנית וחולפתהאירועים במיקרו-סביבה של הגידול. ההליך הדמיה intravital המתואר כאן מגלה אירועים חדשים ואינטראקציות הסלולר במיקרו-סביבה של הגידול כי לא ניתן לפענח מתמונות סטטיות. בעזרת מידע רומן על סוגים או תהליכי תאי אינטראקציה, ואת קינטיקה של אירועים אלה, השערות יכולות להיוצר לחקור את מסלולי האיתות שמניעים את יחסי הגומלין הללו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי שד משרד ההגנה Cancer Research Program תחת מספר הפרסים (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, ותכנית ההדמיה המשולבת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
