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ट्यूमर microenvironment में वास्तविक समय बहुकोशिकीय गतिशीलता की विस्तारित समय व्यतीत हो जाने के intravital इमेजिंग

Published: June 12, 2016 doi: 10.3791/54042
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,3, 1,3,4, 1,3,4
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग बहुकोशिकीय बातचीत की विस्तारित समय चूक इमेजिंग एकल कक्ष संकल्प पर विवो में वास्तविक समय में प्रदर्शन करने का वर्णन है।

Introduction

प्राथमिक स्तन ट्यूमर से ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार मैक्रोफेज और endothelial कोशिकाओं सहित stromal कोशिकाओं न केवल ट्यूमर कोशिकाओं शामिल है, लेकिन मेजबानी करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, ट्यूमर वाहिका में वृद्धि हुई पारगम्यता 1 के साथ असामान्य है। इस प्रकार, का निर्धारण कैसे ट्यूमर कोशिकाओं, मैक्रोफेज और endothelial कोशिकाओं संवहनी पारगम्यता और प्राथमिक ट्यूमर microenvironment में ट्यूमर सेल intravasation मध्यस्थता करने के लिए बातचीत समझ मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है। संवहनी पारगम्यता, ट्यूमर सेल intravasation और ट्यूमर microenvironment में बहुकोशिकीय बातचीत की अंतर्निहित संकेतन तंत्र के कैनेटीक्स को समझना विकास और विरोधी कैंसर चिकित्सा के प्रशासन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

विवो में ट्यूमर संवहनी पारगम्यता का अध्ययन कर के प्राथमिक साधन ऐसे इवांस नीले 2, उच्च आणविक भार dextrans (155 केडीए) के रूप में extravascular रंगों की माप कर दिया गया है3 और डाई के इंजेक्शन के बाद fluorophore या radiotracer संयुग्मित प्रोटीन (एल्बुमिन सहित) 4 तय समय बिंदुओं पर। माइक्रोस्कोपी में प्रगति, पशु मॉडल और फ्लोरोसेंट रंगों intravital माइक्रोस्कोपी से 5 तक सेलुलर प्रक्रियाओं और जीवित पशुओं में संवहनी पारगम्यता के दृश्य के लिए सक्षम है।

कई बार अंक के ऊपर स्थिर चित्र, या कम समय चूक दृश्यों के अधिग्रहण के साथ लाइव पशु इमेजिंग ट्यूमर microenvironment 6.7 में गतिशील घटनाओं की पूरी समझ के लिए अनुमति नहीं है। दरअसल, 24 घंटा के पाठ्यक्रम पर स्थिर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन किया है कि ट्यूमर वाहिका टपका हुआ है, हालांकि संवहनी पारगम्यता की गतिशीलता 6 नहीं मनाया गया। इस प्रकार, 12 घंटे तक बढ़ाया निरंतर समय चूक इमेजिंग ट्यूमर microenvironment में गतिशील घटनाओं के कैनेटीक्स कब्जा।

इस प्रोटोकॉल विस्तारित समय व्यतीत हो जाने के multiphot के उपयोग का वर्णनintravital माइक्रोस्कोपी पर ट्यूमर microenvironment में गतिशील बहुकोशिकीय घटनाओं का अध्ययन करने के लिए। ट्यूमर microenvironment में कई प्रकार की कोशिकाओं के इंजेक्शन रंगों के साथ या फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करके लेबल रहे हैं। एक पूंछ नस कैथेटर संवहनी रंगों या प्रोटीन इमेजिंग की शुरुआत के बाद इंजेक्शन जा सकता है का उपयोग ट्यूमर microenvironment में बहुकोशिकीय घटनाओं की गतिज डेटा प्राप्त करने के लिए। लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक स्तन ट्यूमर त्वचा फ्लैप की शल्य चिकित्सा की तैयारी के माध्यम से अवगत कराया है। छवियाँ एक multiphoton कई photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) डिटेक्टरों 8 से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए 12 घंटे के लिए हासिल किया है। उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करके, एक घटाव एल्गोरिथ्म ट्यूमर microenvironment एक साथ 9 में 5 फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने के लिए 4 पीएमटी डिटेक्टरों सक्षम बनाता है। उच्च संकल्प multiphoton intravital माइक्रोस्कोपी ट्यूमर microenvironment में ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत के एकल कक्ष संकल्प इमेजिंग कब्जा, एक बेहतर करने के लिए अग्रणी Uसंवहनी पारगम्यता और ट्यूमर सेल intravasation 10-13 की nderstanding। विशेष रूप से, विस्तारित intravital इमेजिंग का पता चला अत्यधिक स्थानीय, क्षणिक संवहनी पारगम्यता घटनाओं है कि एक ट्यूमर सेल, एक बृहतभक्षककोशिका और एक endothelial सेल के बीच बातचीत का स्थलों पर चुनिंदा घटित 13 (मेटास्टेसिस, TMEM 14 के ट्यूमर microenvironment के रूप में परिभाषित)। इसके अलावा, ट्यूमर सेल intravasation केवल TMEM पर होता है और स्थानिक और अस्थायी संवहनी पारगम्यता 13 के साथ जोड़ा जाता है। इन घटनाओं की गतिशीलता के एकल कक्ष संकल्प ट्यूमर microenvironment में fluorescently लेबल कोशिकाओं की विस्तारित समय चूक multiphoton माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के माध्यम से संभव बनाया गया था।

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Protocol

वर्णित सभी प्रक्रियाओं के दिशा निर्देशों और चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज द्वारा पूर्व अनुमोदन सहित कशेरुकी जीवों, के उपयोग के लिए नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए।

1. जनरेटिंग fluorescently लेबल ट्यूमर और ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज

  1. बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट सहज, autochthonous, अनुवांशिक इंजीनियर माउस स्तन कैंसर मॉडल जहां माउस स्तन ट्यूमर वायरस लंबे टर्मिनल दोहराने फ्लोरोसेंट संवाददाताओं [यानी साथ ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ड्राइव polyoma बीच टी प्रतिजन (MMTV-PyMT), पार करके fluorescently लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को उत्पन्न प्रोटीन (EGFP), बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ECFP) या Dendra2] 8,9।
  2. PyMT पशुओं में Fluorescently लेबल मैक्रोफेज के साथ fluorescently [यानी, MacGr myeloid- और macrophage- विशिष्ट फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल पार करके ट्यूमर कोशिकाओं लेबलeen 15 या MacBlue चूहों Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP 16]।
  3. वैकल्पिक रूप से, fluorescently fluorescently लेबल PyMT ट्यूमर कोशिकाओं (syngeneic), मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों या प्राथमिक मानव रोगी निकाली गई ट्यूमर (xenografts) 11,17 के ओर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के माध्यम से ट्यूमर लेबल उत्पन्न।
    1. प्रत्यारोपण fluorescently फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल माइलॉयड कोशिकाओं के साथ syngeneic चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं PyMT लेबल fluorescently लेबल ट्यूमर कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं 13 के साथ जानवरों उत्पन्न करते हैं।
  4. मानव कोशिका लाइनों या fluorescently लेबल मैक्रोफेज 2 घंटा शुरू करने से पहले करने के लिए रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक ट्यूमर के जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के साथ गंभीर संयुक्त इम्यूनो (एस.सी.आई.डी) चूहों में 10 मिलीग्राम / किग्रा फ्लोरोसेंट 70 केडीए अंतःशिरा (चतुर्थ) पूंछ नस से dextran के 100 μl इंजेक्षन intravital इमेजिंग की।

2. माइक्रोस्कोप सेटअप और इमेजिंग तैयारी

नोट: यह प्रक्रिया सेट-अप का वर्णनएक multiphoton माइक्रोस्कोप 8 पर intravital इमेजिंग के लिए।

  1. दो photon लेजर और डिटेक्टरों सहित सभी माइक्रोस्कोप और लेजर घटकों पर मुड़ें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग बॉक्स को चालू अवस्था पूर्व गर्म करने के लिए। यह कदम जानवर के शारीरिक तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. एक औंधा माइक्रोस्कोप जगह कस्टम बनाया खुर्दबीन मंच पर चरण डालने पर उपयोग के लिए। कस्टम डालने 1/8 के एक पत्रक इमेजिंग के लिए केंद्र में छेद के माध्यम से व्यास "मोटी एल्यूमीनियम चरण डालने अंतरिक्ष में एक और 1 के साथ फिट करने के लिए machined" है।
    1. खुर्दबीन मंच और 70% इथेनॉल और शुष्क हवा के साथ मंच डालने साफ कर लें।
    2. 20X 1.05 एनए खुर्दबीन उद्देश्य पर पानी की एक बड़ी गिरावट गिलास को कवर के साथ ऑप्टिकल संपर्क बनाए रखने के लिए रखें।
    3. जगह कांच कवर (# 1.5 मोटाई) खुर्दबीन मंच डालने पर इमेजिंग पोर्ट पर। प्रयोगशाला टेप के साथ जगह में सुरक्षित।
    4. एक 2 सेमी x 2 सेमी के छेद पंच के लिए एक छेद पंच का प्रयोग करेंएक लचीला रबर पैड में और पैड कस्टम चरण डालने में छेद के साथ गठबंधन में छेद के साथ खुर्दबीन मंच पर रबर पैड रखें।

इमेजिंग के दौरान इंजेक्शन के लिए पूंछ नस कैथेटर के 3. तैयारी और अभिकर्मकों

  1. पॉलीथीन (पीई) टयूबिंग की एक 30 सेमी लंबाई में कटौती।
  2. संदंश का प्रयोग, एक 31 जी सुई की धातु सुई आगे और पीछे ले जब तक यह प्लास्टिक फिटिंग के बंद टूट जाता है।
  3. संदंश का प्रयोग, पीई ट्यूबिंग में अलग सुई की कुंद अंत डालें।
  4. पीई ट्यूबिंग के दूसरे छोर में एक 31 जी सुई डालें।
  5. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक 1 सीसी सिरिंज भरें और 31 जी सुई में डालने और ट्यूबिंग और पीबीएस के साथ सुई से बाहर सब हवा फ्लश। पीबीएस हाइड्रेशन और रक्त परासारिता 9,18 बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि isotonic खारा भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. 3 मिलीग्राम के 200 μl के साथ एक 1 सीसी सिरिंज भरें / किलो 155 केडीए dextran-tetramethylrhodamine (TMR) या नाड़ी लेबलिंग के लिए क्वांटम डॉट्स।
  7. इस तरह के एक 1 सीसी सिरिंज और बर्फ पर जगह में संवहनी endothelial वृद्धि कारक एक (VEGFA 165) के एक 165 अमीनो एसिड isoform रूप में किसी भी अन्य इंजेक्शन प्रोटीन तैयार करें। 0.05 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में 0.2 मिलीग्राम / किग्रा VEGFA 165 19 इंजेक्षन।

4. निबाह पूंछ नस कैथेटर की प्रविष्टि

  1. संज्ञाहरण के तहत पशु वाहक गैस के रूप में 2 हे के साथ 5% isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष का उपयोग कर रखें।
  2. शल्य चिकित्सा मंच करने के लिए माउस स्थानांतरण बार यह पूरी तरह anesthetized है और एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है।
  3. शल्य चिकित्सा मंच के ओपन isoflurane संज्ञाहरण लाइन, प्रेरण चैम्बर के लिए संज्ञाहरण लाइन को बंद करने और पशु के थूथन के ऊपर नाक शंकु जगह है। 2.5% से 5% से isoflurane कम करें।
  4. माउस संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए की आंखों को नेत्र मरहम लागू करें।
  5. हीटिंग दीपक के तहत पशु गर्मीएक अतिरिक्त 2 मिनट पूंछ में परिसंचरण को बढ़ाने के लिए रक्त परिसंचरण में गहरी संज्ञाहरण के साथ धीमा कर देती है।
  6. 70% इथेनॉल के साथ माउस पूंछ नस जीवाणुरहित।
  7. कैथेटर जानवर के पार्श्व पूंछ नस में धारा 3 में निर्माण से 31 जी सुई की नोक डालें और 2-3 मिमी में सुई धक्का।
  8. खून देखने के लिए सिरिंज पर वापस खींचने, कैथेटर सुनिश्चित पूंछ नस में रखा गया है।
  9. पूंछ की लंबाई के साथ नस के लिए जगह समानांतर में सुई धारण करने के लिए सुई पर रखा प्रयोगशाला टेप का एक 1 सेमी लंबाई का प्रयोग करें।

5. त्वचा प्रालंब सर्जिकल प्रक्रिया स्तन ट्यूमर का पर्दाफाश करने के लिए

  1. शल्य चिकित्सा मंच पर जानवर के साथ झाड़ू ट्यूमर और 70% इथेनॉल के साथ उदर सतह। नोट: के रूप में वर्णित है, इस प्रक्रिया को पूरी तरह से aseptically नहीं किया जाता है। लंबे इमेजिंग सत्र जहां संक्रमण एक confounding कारक बन सकता है के लिए, यह उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
  2. steri का प्रयोगLe संदंश, उदर त्वचा उठा और बाँझ कैंची उदर midline लंबाई में लगभग 1 सेमी के साथ एक चमड़े के नीचे चीरा बनाने के साथ। चीरा दौरान पेरिटोनियम puncturing से बचें।
  3. धीरे संयोजी ऊतक स्तन ग्रंथि और ट्यूमर संलग्न पेरिटोनियम से दूर स्तन ट्यूमर बेनकाब करने के लिए काट दिया।
  4. कैंची और संदंश का प्रयोग, धीरे हटाने और दूर ट्यूमर के उजागर सतह से प्रावरणी और वसा में कटौती करते हुए ट्यूमर वाहिका की अखंडता को बनाए रखने और खून बह रहा है कम से कम। यह कदम ट्यूमर का ट्यूमर वाहिका वास्तुकला और आपूर्ति बनाए रखने में महत्वपूर्ण है।

6. माइक्रोस्कोपी के लिए पशु तैयारी

  1. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य के ऊपर चरण डालने पर coverslip पर रखा उजागर ट्यूमर के साथ पूर्व गर्म इमेजिंग चरण के लिए पशु स्थानांतरण। जानवर के साथ धीरे पूंछ नस कैथेटर हस्तांतरण करने के लिए इतनी के रूप में सुई को बेदखल करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  2. प्लेस वेंपशु के थूथन से अधिक ई संज्ञाहरण नाक शंकु 3% isoflurane संज्ञाहरण सेट बनाए रखने के लिए।
  3. जानवरों की स्थिति तो यह है कि ट्यूमर रबर पैड के छेद में टिकी हुई है और गिलास coverslip के साथ संपर्क में आता है।
  4. दो रबर पैड का प्रयोग धीरे जगह में ट्यूमर पकड़ और छवि अधिग्रहण के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए प्रयोगशाला टेप के साथ खुर्दबीन चरण के लिए उन्हें ठीक करने के लिए।
  5. पीबीएस के साथ रबर पैड से चैम्बर भरें ऊतक हाइड्रेटेड रखने के लिए और coverslip के साथ ऑप्टिकल संपर्क बनाए रखने के लिए।
  6. एक पल्स oximeter जांच के साथ पशु के महत्वपूर्ण संकेत निगरानी शुरू। जानवर की जांघ के लिए एक क्लिप सेंसर संलग्न। वैकल्पिक रूप से एक कॉलर कि गले में फिट करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. जानवर पर हीटिंग बॉक्स प्लेस 30 डिग्री सेल्सियस 20 बनाए रखने के लिए।
  8. धीरे-धीरे संज्ञाहरण बनाए रखने और रक्त प्रवाह को बनाए रखने के लिए 0.5-1% isoflurane के स्तर को कम।

7. छवि के अधिग्रहण और fluoresc इंजेक्शनईएनटी रंगों और इंजेक्शन प्रोटीन

  1. ट्यूमर की सतह पर फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं पर माइक्रोस्कोप आईपीस फोकस का उपयोग करना।
  2. रक्त वाहिकाओं बहने के साथ क्षेत्रों खोजने के द्वारा ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें। बहने रक्त वाहिकाओं के साथ ब्याज की एक क्षेत्र का चयन ट्यूमर वाहिका का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. एक बार ब्याज की एक क्षेत्र का चयन किया गया multiphoton इमेजिंग मोड में माइक्रोस्कोप स्विच।
  4. एक जेड श्रृंखला के ऊपरी और निचले सीमा निर्धारित करें। फोकस समायोजक का उपयोग कर वांछित शुरुआत स्थान पर स्थानांतरित करने के लिए उद्देश्य और Z स्थिति "टॉप" बटन पर क्लिक करके जेड श्रृंखला की ऊपरी सीमा निर्धारित करें। दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) चैनल में ट्यूमर की सतह पर कोलेजन फाइबर नेटवर्क visualizing और देख जब कोई कोशिकाओं लेकिन केवल कोलेजन फाइबर दिखाई दे रहे हैं द्वारा जेड श्रृंखला की ऊपरी सीमा निर्धारित करते हैं।
    1. वांछित इमेजिंग गहराई तक ले जाकर उद्देश्य जेड श्रृंखला की निचली सीमा सेट (typically 50 - 150 सुक्ष्ममापी) और जेड स्थिति क्लिक "नीचे" बटन।
    2. कदम आकार क्षेत्र में वांछित मूल्य टाइप करके कदम आकार सेट करें। संकल्प और अधिग्रहण के समय के लिए विचार के आधार पर कदम आकार का निर्धारण करते हैं (आम तौर पर 2 माइक्रोन उच्च संकल्प 3 डी पुनर्निर्माण के लिए 5 माइक्रोन अन्यथा प्रयोग किया जाता है)।
  5. समय चूक क्षेत्र में समय चूक पैनल के लिए स्विचन और वांछित चूक समय दर्ज करके समय व्यतीत हो जाने के अंतराल सेट करें। इष्टतम अस्थायी समाधान के लिए 0 निरंतर इमेजिंग के लिए सेकंड का समय अंतराल सेट। नोट: लंबे समय से चूक इमेजिंग के लिए यह उद्देश्य विसर्जन तरल भरपाई करने के लिए अधिग्रहण के बीच 10 सेकंड के लिए समय अंतराल सेट करने के लिए सिफारिश की है।
  6. एक बार इमेजिंग के लिए मानकों को निर्धारित किया गया है, धीरे-धीरे 155 केडीए dextran-TMR इंजेक्षन।
    1. पूंछ नस कैथेटर में पीबीएस के साथ सिरिंज निकालें और ली में किसी भी बुलबुले परिचय नहीं 155 केडीए dextran-TMR ख्याल रख रही युक्त सिरिंज के साथ बदलेंne।
    2. धीरे धीरे, माउस में 155 केडीए dextran-TMR इंजेक्षन 200 μl की अधिकतम मात्रा के साथ, और सिरिंज पीबीएस युक्त साथ सिरिंज की जगह। महत्वपूर्ण कदम: इंजेक्शन धीरे धीरे प्रदर्शन और सावधानी बरतने की नस के बाहर समाधान हो रही से बचने के लिए।
  7. उन्हें दबाना Z ढेर और समय चूक बटन पर क्लिक करके और फिर रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करके Z ढेर समय चूक इमेजिंग का अधिग्रहण शुरू करो।
  8. अन्य फ्लोरोसेंट dextrans, यानी, 10 केडीए dextran-fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC), या प्रोटीन, यानी, VEGFA 165, पहले से तैयार किया गया है, उनमें 0 पर = मिनट शुरुआत के लिए छवि अधिग्रहण की शुरुआत के बाद इंजेक्षन।
    1. पूंछ नस कैथेटर में पीबीएस के साथ सिरिंज निकालें और 10 केडीए dextran-FITC या VEGFA 165 ख्याल रख रही युक्त लाइन में किसी भी बुलबुले परिचय नहीं सिरिंज के साथ बदलें।
    2. धीरे धीरे पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से माउस में इंजेक्टेबल इंजेक्षनऔर एक सिरिंज पीबीएस युक्त साथ सिरिंज की जगह।
  9. हर 30-45 मिनट, धीरे-धीरे पशु के जलयोजन बनाए रखने के लिए पीबीएस या खारा के 50 μl इंजेक्षन।

8. इच्छामृत्यु

  1. छवि अधिग्रहण की समाप्ति पर, पशु euthanize।
    1. 5% isoflurane बढ़ाएँ।
    2. 30 सेकंड तक 5% isoflurane के तहत पशु रखें यह साँस लेने और मंच से पशु को दूर करने के लिए रहता है के बाद।
    3. पूरा इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करना।

9. इमेज प्रोसेसिंग

  1. हर समय बिंदु पर प्रत्येक व्यक्ति के चैनल के लिए 16-बिट झगड़ा फाइलों में छवियों के अधिग्रहण और क्रमिक रूप से बचाने के लिए।
  2. वर्णक्रमीय ओवरलैप (यानी, GFP और सीएफपी), XY बहाव के उन्मूलन और समय चूक ImageJ 9 में स्थापित तरीकों का उपयोग कर दृश्यों से फिल्मों की पीढ़ी की जुदाई प्रदर्शन करना। उच्च संकल्प छवियों 13 के 3 डी सतह पुनर्निर्माण कार्य करें।

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Representative Results

विस्तारित समय व्यतीत हो जाने के intravital माइक्रोस्कोपी ट्यूमर microenvironment में बहुकोशिकीय प्रक्रियाओं के एकल कक्ष संकल्प इमेजिंग सक्षम बनाता है। fluorescently लेबलिंग ट्यूमर कोशिकाओं, मैक्रोफेज, नाड़ी अंतरिक्ष, और कोलेजन फाइबर दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी संकेत का उपयोग कर नेटवर्क visualizing करके, ट्यूमर microenvironment में कई डिब्बों के एक साथ इमेजिंग के दौरान पता लगाया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल ट्रांसजेनिक चूहों में उत्पन्न किया जा सकता है, क्योंकि MMTV-PyMT-Dendra2 चूहों में किया गया है, Dendra2 (चित्रा 1 ए) के साथ लेबल स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ। Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP चूहों के साथ इन ट्रांसजेनिक चूहों, जो ECFP के साथ लेबल मैक्रोफेज राशि को पार करके, दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज MMTV-PyMT चूहों में चिह्नित कर रहे हैं। ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज की दोहरी लेबलिंग रणनीति के साथ, दो कोशिकाओं प्रकार की सीधी बातचीत वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं (चित्रा 1 ए)। इसके अतिरिक्त, मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं लाइनों या रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं GFP के साथ transduced ट्यूमर कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है। मैक्रोफेज fluorescently लेबल 70 केडीए dextran जो phagocytic मैक्रोफेज (चित्रा 1 बी) में जम जाता है का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है। इन तरीकों में इस तरह के ट्यूमर सेल बृहतभक्षककोशिका स्ट्रीमिंग गतिशीलता, संवहनी पारगम्यता और ट्यूमर सेल intravasation के रूप में गतिशील बहुकोशिकीय घटनाओं के अध्ययन को बढ़ावा दिया है। ट्यूमर संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए, एक fluorescently लेबल उच्च आणविक भार dextran (155 केडीए या उच्चतर 9,13,21,22 सिफारिश की है) या क्वांटम डॉट्स संवहनी अंतरिक्ष (चित्रा 1) लेबल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 155 केडीए dextran या क्वांटम डॉट्स काफी बड़ी है कि वे आसानी से interendothelial रिक्त स्थान 23 के माध्यम से फैलाना नहीं कर रहे हैं।

सतत उच्च संकल्प इमेजिंग संवहनी पारगम्यता घटनाओं और का कब्जा की सुविधाTMEM (चित्रा 2 और मूवी 1) में dextran परिस्त्राव और निकासी के कैनेटीक्स की मात्रा। चूंकि संवहनी अंतरिक्ष आसानी से 155 केडीए dextran द्वारा समय चूक अनुक्रम की दीक्षा में (0 में 'के रूप में चित्रा 2) परिभाषित किया गया है extravascular फ्लोरोसेंट dextran समय चूक अनुक्रम के हर फ्रेम में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 2 और मूवी 1 से 155 केडीए dextran-TMR एक MMTV-PyMT-Dendra2 में एक पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से इंजेक्शन परिस्त्राव का प्रदर्शन, Csf1r-सीएफपी माउस। Dendra2 लेबल ट्यूमर कोशिकाओं (हरा) और CFP लेबल मैक्रोफेज (सियान) जीवित पशुओं में TMEM की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। संवहनी पारगम्यता के स्थल पर TMEM संरचना एक सफेद बॉक्स में उल्लिखित है। संवहनी अंतरिक्ष संवहनी पारगम्यता की घटनाओं के दौरान वाहिका और नाड़ी सामग्री की परिस्त्राव बहने कल्पना करने के लिए 155 केडीए dextran-TMR (लाल) के साथ लेबल है। 155 केडीए dextran-TMR परिस्त्राव के शिखरचित्रा में 2 29 'और 34' के बीच देखा जाता है। Extravascular dextran शीर्ष पैनल में सफेद नोक पर और कम पैनल में लाल नोक पर देखा जाता है, 155 केडीए dextran-TMR के ही चैनल दिखा। 155 केडीए dextran-TMR ऊतक से साफ करता है और extravascular TMR संकेत के रूप में चित्रा 2 में 97 में 'देखा में कमी के रूप में देखा जाता है। ImageJ extravascular dextran में समय व्यतीत हो जाने के अनुक्रम का संकलन करने के बाद मात्रा निर्धारित है।

ट्यूमर microenvironment में सहज घटनाओं का अवलोकन करने के लिए इसके अलावा, यह पहचान घटना के अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। अतिरिक्त संवहनी रंजक या संवहनी पारगम्यता प्रेरित करने के लिए संवहनी पारगम्यता को विनियमित करने के संकेत घटनाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं प्रोटीन इंजेक्शन। चित्रा 3 से 10 केडीए dextran-FITC (हरा) और 155 केडीए dextran-TMR (लाल) की परिस्त्राव में अंतर को दर्शाता है।उच्च आणविक भार 155 केडीए dextran-TMR समय चूक इमेजिंग के शुरू होने से ठीक पहले किया जाता है। पांच जेड के ढेर समय व्यतीत हो जाने के क्रम में अर्जित कर रहे हैं इससे पहले 10 केडीए dextran-FITC इंजेक्ट किया जाता है एक आधारभूत स्थापित करने के लिए। 5 वीं के अधिग्रहण के बाद छवि अधिग्रहण के दखल के बिना Z ढेर 10 केडीए dextran-FITC पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से किया जाता है। जबकि 155 केडीए dextran-TMR संवहनी अंतरिक्ष (चित्रा 3, 0 'और' 6) तक ही सीमित रहता है dextran-FITC तत्काल परिस्त्राव साथ वाहिका प्रवेश देखा है। 10 केडीए dextran-FITC पूरी तरह से रक्त वाहिनियों से extravasates और ऊतकों रक्त वाहिका (चित्रा 3 के रूप में 56 'और फिल्म 2 में देखा) में 155 केडीए dextran-TMR छोड़ने से साफ करता है। इंजेक्शन से पहले से एक समय बिंदु का प्रयोग, 10 केडीए dextran-FITC परिस्त्राव के कैनेटीक्स आसानी से 155 केडीए dextran-TMR 13 की तुलना में हो सकता है। 10 केडीए dextr के तत्काल परिस्त्रावइंजेक्शन के बाद एक-FITC वाहिका में 155 केडीए dextran-TMR की अवधारण और सहज संवहनी पारगम्यता घटनाओं 13 से काफी अलग है। अतिरिक्त प्रयोगात्मक नियंत्रण endothelium के या VEGFA 165 मध्यस्थता पारगम्यता 13 के माध्यम से यांत्रिक विघटन के माध्यम से संवहनी पारगम्यता उत्प्रेरण सहित प्रदर्शन किया जा सकता है। सहज पारगम्यता घटनाओं के 155 केडीए dextran-TMR की परिस्त्राव के कैनेटीक्स 10 केडीए dextran, और नाड़ी पारगम्यता उत्प्रेरण घटनाओं और संकेतों ट्यूमर microenvironment में संवहनी पारगम्यता घटनाओं में शामिल समझने के लिए अन्य साधनों की तुलना में हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. ट्यूमर microenvironment में कोशिकाओं और वाहिका लेबलिंग के लिए रणनीतियाँ। (ए) Dendra2 के साथ लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ट्रांसजेनिक MMTV-PyMT माउस (एमएमटीवी-iCre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) और सीएफपी के साथ लेबल मैक्रोफेज (Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP)। ट्यूमर वाहिका 155 केडीए dextran-TMR पूंछ नस कैथेटर द्वारा प्रशासित साथ लेबल है। (बी) TN1-GFP रोगी व्युत्पन्न 70 केडीए dextran टेक्सास लाल के साथ लेबल मैक्रोफेज और वाहिका क्वांटम डॉट्स पूंछ नस कैथेटर का उपयोग कर के साथ लेबल के साथ जेनोग्राफ्ट ट्यूमर। स्केल बार, 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. क्षणिक संवहनी पारगम्यता Visualizing। (ए) intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) 155 केडीए dextran-TMR (लाल) परिस्त्राव और ट्यूमर सेल intravasation की TMEM पर समय चूक (सफेद बॉक्स)। ट्यूमर कोशिकाओं Dendra2 (हरे, टीसी), ECFP साथ मैक्रोफेज (सियान, एम) और blo के साथ लेबल155 केडीए dextran-TMR (लाल, बी.वी.) के साथ आयुध डिपो वाहिकाओं। रक्त वाहिका पारगम्यता साइटों (सफेद नोक)। (बी) पृथक 155 केडीए dextran-TMR चैनल। लाल तीर dextran परिस्त्राव (सफेद) निशान। स्केल बार, 50 माइक्रोन। 1 मूवी में समय चूक माइक्रोस्कोपी की फिल्म है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Visualizing कई fluorescently लेबल dextrans। 155 केडीए dextran-TMR (लाल) और 10 केडीए dextran-FITC (हरा) के परिस्त्राव में अंतर का IVM समय व्यतीत हो। मैक्रोफेज ECFP (सियान) और नीले (एसएचजी) में कोलेजन के साथ लेबल रहे हैं। लाल 155 केडीए dextran-TMR की ओवरले और वाहिका में हरे रंग की 10 केडीए dextran-FITC पीला है। हरे रंग की 10 केडीए dextran-FITC चोटी के रैपिड परिस्त्राव 6 मिनट पर है। scalई बार, 50 माइक्रोन। फिल्म 2 में समय चूक माइक्रोस्कोपी की फिल्म है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
मूवी 1. समय चूक IVM के साथ सहज क्षणिक संवहनी पारगम्यता Visualizing। समय चूक माइक्रोस्कोपी क्षणिक रक्त वाहिका पारगम्यता Dendra2 (MMTV-iCre / CAGCAT के साथ लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक ट्रांसजेनिक MMTV-PyMT माउस में कल्पना की (चित्रा 2 में देखा) -Dendra2 / MMTV-PyMT) और सीएफपी (Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP) के साथ लेबल मैक्रोफेज। 155 केडीए dextran-TMR परिस्त्राव (बाएं पैनल में लाल, सफेद सही पैनल) की परिस्त्राव ट्यूमर रक्त वाहिनियों की शाखा बिंदु पर मनाया जाता है। पीपट्टे इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

फिल्म 2
मूवी 2. समय चूक IVM द्वारा कई fluorescently लेबल dextrans की परिस्त्राव Visualizing। एक ट्रांसजेनिक में 155 केडीए dextran-TMR (लाल) और 10 केडीए dextran-FITC (हरा) के परिस्त्राव के समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 में देखा) सीएफपी (Csf1r -GAL4VP16 / यूएएस ECFP) के साथ लेबल मैक्रोफेज के साथ MMTV-PyMT माउस। कोलेजन के स्वयं सहायता समूह के नीले रंग में लेबल है। रेड 155 केडीए dextran-TMR समय चूक की अवधि के लिए ट्यूमर वाहिका में रहता है, जबकि हरी 10 केडीए dextran-FITC तेजी से extravasates और रक्त वाहिकाओं और ऊतकों से साफ करता है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

सेलुलर बातचीत है कि ट्यूमर microenvironment में सहज होते ट्यूमर सेल गतिशीलता और intravasation में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। लाइव ट्यूमर के ऊतक के उच्च संकल्प intravital इमेजिंग बहु सेलुलर गतिशीलता है कि अत्यधिक क्षणिक 10,13,24 हो सकता है के दृश्य परमिट। विवो assays या समय चूक छवियों असतत समय अंक के साथ प्राप्त ट्यूमर microenvironment में प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र पर आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं में अंत बिंदु। Intravital इमेजिंग अध्ययन ट्यूमर microenvironment में प्रक्रियाओं कई दिनों से अधिक होती है कि अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, नशीली दवाओं के उपचार के लिए 25-30 angiogenesis, ट्यूमर सेल प्रवास और प्रतिक्रिया पर नए अंतर्दृष्टि पैदा होता है। हालांकि, इन assays प्रक्रियाओं के समय के पैमाने के कारण ट्यूमर microenvironment में क्षणिक घटनाओं के कैनेटीक्स पर कब्जा नहीं कर सकता 7,31 का अध्ययन किया जा रहा है। लगातार प्रक्रियाओं से कई क्षणिक घटनाओं भेद एक महत्वपूर्ण विज्ञापन हैintravital माइक्रोस्कोपी की सहूलियत।

intravital इमेजिंग तकनीक इस प्रोटोकॉल में वर्णित कई सेल प्रजातियों और संरचनाओं के प्रतिदीप्ति लेबलिंग से ट्यूमर microenvironment में सेलुलर गतिशीलता के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। Multiphoton माइक्रोस्कोपी 300 माइक्रोन की गहराई के साथ एकल फोटान confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के ऊपर का अधिक से अधिक गहराई नियमित प्रदर्शन 24 परमिट। 50 के जेड के ढेर के अधिग्रहण - 100 माइक्रोन 2 माइक्रोन कदम के साथ सेलुलर बातचीत के 3D पुनर्निर्माण, उभार है कि कोशिकाओं के रूप में वे ट्यूमर microenvironment में एक दूसरे को 13 और संवहनी संरचनाओं की ओर विस्तार करना भी शामिल है उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त उच्च संकल्प की है। सिनेमा और समय चूक छवि दृश्यों से 3D पुनर्निर्माण सेलुलर गतिशीलता (गति और दिशात्मकता) के quantitation के लिए अनुमति देते हैं और, इंजेक्शन रंजक, संवहनी पारगम्यता के फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता में परिवर्तन का उपयोग कर।

आदेश सपा कब्जा करने के लिएontaneous सेलुलर घटनाओं के लिए एक एकल अनुक्रम में कब्जा व्यक्तिगत छवियों की संख्या छवि अधिग्रहण की दर है कि घटना के कैनेटीक्स कब्जा करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन वह भी एक पर्याप्त शारीरिक अंतरिक्ष को शामिल किया दौरान किसी भी व्यक्तिगत स्पर्धा पर कब्जा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए एक ही समय व्यतीत हो जाने के अनुक्रम। स्थानिक इमेजिंग मानकों पर विचार करने की जरूरत है कि शामिल हैं; एक जेड ढेर में स्लाइस की संख्या, जेड ढेर हासिल कर लिया और एक जेड ढेर में व्यक्तिगत स्लाइस के बीच अक्षीय दूरी के साथ देखने के क्षेत्रों की संख्या। इसलिए, छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले इन मानकों की स्थापना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। multiphoton सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, एक जेड श्रृंखला में 30 फ्रेम (500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन) के अधिग्रहण के लगभग 60 सेकंड है। के बाद से मनाया ट्यूमर सेल intravasation की अवधि मिनट 13 के आदेश पर हो सकता है, intravasation के 3D पुनर्निर्माण के लिए कई जेड के ढेर पर कब्जा करने, एक जेड ढेर के अधिग्रहण के समय टी सीमित थाओ 60 सेकंड। इसलिए, एक जेड ढेर में करने के लिए 30 स्लाइस के साथ देखने का एक ही क्षेत्र का अधिग्रहण किया गया था। इसके अलावा, के बाद से कोशिकाओं के 3D पुनर्निर्माण वांछित था, जेड-स्लाइस के बीच अक्षीय चरण 2 माइक्रोन में स्थापित किया गया था। इस 3 डी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए सेल की मात्रा पर पर्याप्त जानकारी के लिए अनुमति देता है। इन मानकों जीने की घटनाओं के कैनेटीक्स अध्ययन किया जा रहा है पर आधारित इस्तेमाल किसी भी खुर्दबीन और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

खुर्दबीन मंच और पूंछ नस चतुर्थ कैथेटर पर रबर पैड के संशोधन दोनों इमेजिंग समय में एक उल्लेखनीय वृद्धि के लिए अनुमति दी है। रबर पैड रूपों एक अच्छी तरह से करते हुए कांच coverslip पर XY बहाव को कम ट्यूमर के बनाए रखा हाइड्रेशन के लिए अनुमति देने के लिए। पीबीएस के प्रशासन के साथ हीटिंग चैम्बर के संयोजन हाइड्रेशन और जानवरों की शारीरिक तापमान को बनाए रखता है। संयुक्त संवहनी छिड़काव और रक्त प्रवाह को बनाए रखने के लिए इन शर्तों ट्यूमर वीएएस पर सेलुलर घटनाओं की विस्तारित इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिएसंवहनी पारगम्यता और ट्यूमर सेल intravasation सहित culature।

इस तकनीक की एक सीमा है फ्लोरोसेंट लेबल है कि ट्यूमर microenvironment में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की संख्या है। अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं (यानी, endothelial कोशिकाओं, fibroblasts या pericytes) फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त के साथ ट्रांसजेनिक चूहों उत्पन्न कठिन और समय लग सकता है। हालांकि, भविष्य की संभावित अनुप्रयोगों प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के 70 केडीए dextran लेबलिंग के साथ stromal सेल प्रकार के फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग का एक संयोजन का उपयोग कर सकता है। इन रणनीतियों लेबलिंग के संयोजन का उपयोग और ट्रांसजेनिक चूहों को पार करके सेलुलर लेबल के नए संयोजन ट्यूमर microenvironment में सेलुलर आंदोलन और घटनाओं का आकलन करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है।

immunofluorescence धुंधला के आधार पर अंत बिंदु प्रयोगों के विपरीत, उच्च संकल्प intravital माइक्रोस्कोपी सहज और क्षणिक के दृश्य परमिटट्यूमर microenvironment में घटनाओं। intravital इमेजिंग प्रक्रिया यहाँ वर्णित नई घटनाओं और ट्यूमर microenvironment में सेलुलर बातचीत है कि स्थिर छवियों से deciphered नहीं किया जा सकता का पता चलता है। बातचीत के दौरान कोशिकाओं प्रकार या प्रक्रियाओं, और इन घटनाओं के कैनेटीक्स पर उपन्यास जानकारी के साथ परिकल्पना संकेत दे रास्ते कि इन मुलाकातों ड्राइव की जांच करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध के रक्षा विभाग स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार संख्या (ऐश, W81XWH-13-1-0010) के तहत, एनआईएच CA100324, PPG CA100324, और एकीकृत इमेजिंग प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate Sigma Aldrich T1287 reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red Life Technologies D-1830 reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate Sigma Aldrich FD10S reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots Life Technologies Q21561MP Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice Jackson Laboratory 2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) Jackson Laboratory 26051
Csf1r-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
1x PBS Life Technologies
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip BD 309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle BD 305128
Polyethylene micro medical tubing  Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass Corning 2980-225 thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors Kent Scientific
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
soft rubber pad McMaster-Carr 8514K62 Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad McMaster-Carr 8568K615 High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope Olympus The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set McMaster-Carr 3429A12 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch

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References

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ट्यूमर microenvironment में वास्तविक समय बहुकोशिकीय गतिशीलता की विस्तारित समय व्यतीत हो जाने के intravital इमेजिंग
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Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (112), e54042, doi:10.3791/54042 (2016).

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