RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em> المستوحدة الليستيريا</em> في خلايا البلاعم
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا ─ البكتيريا المسببة للأمراض المعدية وقادرة على النمو والتكاثر داخل الخلايا الجنود البشري ─ لا مشكلة صحية رئيسية في جميع أنحاء العالم 5. غزو وتكرار داخل الخلية الثديية، وقد اكتسبت مسببات الأمراض داخل الخلايا آليات الفوعة متطورة والعوامل. في حين أن هذه الآليات الأساسية إلى القدرة على التسبب في المرض، ونحن لا نعرف إلا القليل عن تنظيم وديناميتها. منذ ملامح التعبير الجيني من البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائل لا تعكس البيئة الفعلية داخل الخلايا المضيفة، هناك حاجة متزايدة لTranscriptome على تحليل البكتيريا نما في منافذها داخل الخلايا. وهذه التحليلات تمكين فك رموز من التعديلات البكتيرية المحددة الناجمة عن المضيف، وسوف تساعد على تحديد أهداف جديدة للتصميم العلاجية. تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية التي تشكل تحديا كبيرا منذ RNA الثدييات يفوق عدد الجيش الملكي النيبالي البكتيرية التي كتبها فيلا يقل عن عشرة أضعاف. في هذا المخطوط، وصفنا طريقة تجريبية لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من الليستيريا المستوحدة نمو البكتيريا داخل خلايا البلاعم الفئران. الحمض النووي الريبي المستخرج يمكن استخدامها لدراسة التعديلات داخل الخلايا وآليات الفوعة من البكتيريا المسببة للأمراض من خلال تقنيات مختلفة من التحليل النسخ، مثل RT-PCR، RNA تسلسل، ميكروأري وغيرها من التكنولوجيات التهجين مقرها.
اللستيريا L. هي العامل المسبب لداء الليستريات في البشر، وهو مرض مع المظاهر السريرية تستهدف في المقام الأول الأفراد المناعة والمسنين والنساء الحوامل 6. هذا هو الممرض داخل الخلايا الاختياري موجبة الجرام أن يغزو مجموعة واسعة من خلايا الثدييات التي استخدمت لعقود نموذجا في التفاعلات المضيف الممرض يدرس 7. على الغزو، ويقيم في البداية في فجوة أو يبلوع (في حالة الخلايا البلعمية)، والتي يجب أن الهروب إلى رانه استضافة العصارة الخلوية الخلية من أجل تكرار. وقد تبين أن عدة عوامل الفوعة للتوسط في عملية الهروب، وعلى رأسها ما يسمى بحالة دموية تشكيل المسام، Listeriolysin O (LLO) واثنين من فوسفوليباز إضافية 8. في العصارة الخلوية للبكتيريا تستخدم المضيف الآلات الأكتين البلمرة لدفع أنفسهم على خيوط الأكتين داخل الخلية وتنتقل من خلية إلى أخرى (الشكل 1). كلها عوامل الفوعة الرئيسية للL. اللستيريا المشاركة في الغزو، والبقاء داخل الخلايا وتكرارها، وتفعيلها من خلال النسخ المنظم الفوعة الماجستير، PrfA. 8-10.
في العقد الماضي، العديد من الدراسات التي أجريت من قبل الولايات المتحدة وآخرون أساليب تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية تطبيقها بنجاح داخل الخلايا المضيفة 2،11-15. وتستخدم نهجين رئيسيين لفصل الحمض النووي الريبي البكتيرية من المضيف الحمض النووي الريبي والتي تقوم على: 1) إثراء الانتقائي من الحمض النووي الريبي البكتيرية و2) عزل الحمض النووي الريبي عن طريق زراعية مختلفةتحلل الخلية rential. يعتمد الأسلوب الأول على التهجين مطروح من إجمالي مقتطفات الحمض النووي الريبي لجزيئات الحمض النووي الريبي الثدييات (على سبيل المثال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا) أو التقاط الانتقائي للتسلسل كتب البكتيرية (الاسكتلنديين) 11. ويعتمد النهج الثاني على تحلل التفاضلية من البكتيريا والخلايا المضيفة، التي يتم فيها هي lysed الخلايا المضيفة بينما تبقى الخلايا البكتيرية سليمة. ثم يتم فصل الخلايا البكتيرية من المحللة الخلية المضيفة، عادة عن طريق الطرد المركزي، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام التقنيات القياسية. المشكلة الرئيسية باستخدام هذا النهج هو الذي جنبا إلى جنب مع البكتيريا سليمة، يتم عزل الخلايا المضيفة أيضا نوى، وبالتالي فإن الاستعدادات الحمض النووي الريبي لا تزال تحتوي على الحمض النووي الريبي الثدييات. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة هي فصل البكتيريا سليمة من نوى الخلايا المضيفة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، رغم أن هذا الإجراء عادة ما يستغرق وقت رفع قلق من التغيرات في الجينات الشخصية التعبير أثناء الاستخراج. في هذه الورقة نقدم لبا تحسين والسريعبروتوكول استخراج cteria RNA، الذي يقوم على نهج تحلل الخلية التفاضلية. أولا، L. وهي lysed اللستيريا إصابة خلايا البلاعم مع الماء البارد. وبعد ذلك، تتم إزالة النوى بلعم بواسطة الطرد المركزي وجيزة والبكتيريا سليمة يتم جمع بسرعة على مرشحات، والتي من الحمض النووي الريبي المعزولة من خلال استخراج الفينول SDS الساخن من الأحماض النووية البكتيرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها هنا يمثل طريقة الأمثل لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من L. المستوحدة نمو البكتيريا داخل الخلية في خلايا البلاعم. ويستند هذا البروتوكول على تحلل الخلية التفاضلية وتضم اثنين من الخطوات الرئيسية لتخصيب اليورانيوم من الحمض النووي الريبي البكتيري…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
Riferimenti
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
