RNA 정제는 세포 내에서 재배<em> 리스테리아</em> 식세포 세포에
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
세포 내 세균 병원체 ─ 전염병 성장과 인간의 호스트의 내부 세포를 재생할 수있는 원인이 박테리아는 ─ 전세계 주요 건강 문제 5입니다. 침입 포유 동물 세포 내에서 복제하는 세포 내 병원체는 병원성 정교한 메커니즘 요인을 취득했다. 이러한 메커니즘은 질병을 일으킬 수있는 능력에 기초하지만, 우리는 그들의 규제와 역학에 대해 조금 알고있다. 액체 배지에서 자란 균의 유전자 발현 프로파일을 숙주 세포 내에서 실제 환경을 반영하지 않기 때문에, 이들의 세포 내 틈새에서 자란 균 사체 분석에 대한 필요가 커지고있다. 이러한 분석은 호스트에 의해 트리거 특정 세균 적응의 해독을 가능하게 할 것이다 및 치료 설계를위한 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 포유 동물의 RNA가에 의한 세균의 RNA를 능가하기 때문에 세포 내 성장 세균의 사체 분석은 매우 도전최소 10 배. 이 논문에서 우리는 쥐의 대 식세포의 세포 안에 성장 리스테리아 박테리아에서 세균의 RNA를 분리하는 실험 방법을 설명합니다. 추출 된 RNA는 세포 적응 및 RT-PCR, RNA-SEQ 마이크로 어레이 혼성화 및 다른 기반 기술로서 전사 분석의 다양한 기술에 의해 병원균의 독성 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
리스테리아 모노 사이토 겐은 인간의 리스테리아 증의 원인이되는 에이전트, 주로 면역 개인, 노인과 임산부 (6)를 대상으로 임상 증상을 가진 질환이다. 이것 7 연구 호스트 병원체 상호 작용 모델로서 수십 년 동안 사용 된 포유 동물 세포의 다양한 침입 그람 양성 통성 세포 내 병원체이다. 침입하면, 그것은 t로 탈출 해야하는에서 액포 또는 (식세포의 경우) phagosome, 초기에 상주그는 복제하기 위해 세포의 세포질을 호스팅합니다. 여러 병원성 인자는 이스케이프 프로세스 주로 조공 용혈,리스 테리 오라 O (LLO) 및 포스 포 개의 추가 8을 중재하는 것으로 밝혀진 바있다. 세포질에서 박테리아 (그림 1) 세포 내에서 액틴 필라멘트에 자신을 추진 세포에 세포에서 확산 호스트 액틴의 중합 기계를 사용합니다. L.의 모든 주요 독성 요인 침략, 세포 생존과 복제에 관여하는 모노 사이토는, 마스터 독성 전사 조절에 의해 PRFA. 8-10 활성화됩니다.
지난 10 년 동안 여러 연구는 우리가 수행 등을 성공적으로 숙주 세포 2,11-15 내부 세포 내 성장 세균의 사체 분석 방법을 적용했습니다. diffe에 의한 세균의 RNA의 1) 선택적 농축 및 2) RNA 분리 : 두 가지 주요 접근 방식을 기반으로 호스트 RNA에서 세균의 RNA를 분리하는 데 사용됩니다rential 세포 용해. 첫 번째 방법은 (시판 키트를 사용하여 예를 들어) 포유 동물의 RNA 분자에 총 RNA 추출물의 감산 하이브리드 또는 박테리아 전사 시퀀스 (SCOTS) (11)의 선택적 캡처에 의존합니다. 두 번째 방법은 균체 그대로 유지하면서 숙주 세포가 용해되어있는 박테리아 숙주 세포의 용해 차분에 의존한다. 세균 세포는 일반적으로 원심 분리에 의해, 숙주 세포 용 해물로부터 분리되고, RNA는 표준 기술을 이용하여 추출 하였다. 이 방법을 사용하는 가장 큰 문제는 그 본래의 박테리아가 숙주 세포의 핵은 또한 분리되어 함께, 따라서 RNA 제제가 여전히 포유류 RNA를 포함한다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은이 절차는 일반적으로 추출 동안 유전자 발현 프로파일의 변화의 관계를 상승 시간이 필요하지만, 차등 원심 분리를 이용하여 숙주 세포 핵에서 그대로 박테리아를 분리하는 것이다. 본 논문에서는 개선 및 신속한 바 제시셀 차동 용해 방식에 기초 cteria RNA 추출 프로토콜. 첫째, L. 대식 세포를 감염 모노 사이토 겐을 냉수로 용해된다. 다음으로, 대식 세포 핵에 대한 간단한 원심 분리하여 제거하고 그대로 박테리아가 빠르게하는 RNA에서 세균의 핵산의 뜨거운 페놀 SDS 추출을 사용하여 격리, 필터에 수집됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 L.에서 세균 RNA의 분리를위한 최적의 방법을 나타냅니다 대식 세포에서 세포 내 성장 세균 모노 사이토 겐. 이 프로토콜은 세포 용해 차분에 기초하여 세균 RNA의 농축을위한 두 가지 주요 단계를 포함한다 : 원심 분리 및 여과에 의해 박테리아의 신속한 수집을 사용하여 대 식세포 핵 침강. 이 단계는 표준 RNA 추출 과정 뒤 따른다. 이 프로토콜은 listerial RNA?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
Riferimenti
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