RNA Purificazione da nella cellula Grown<em> Listeria monocytogenes</em> In macrofagi
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Intracellulari batteri patogeni ─ batteri che causano malattie infettive e in grado di crescere e riprodursi all'interno delle cellule di ospiti umani ─ sono un grave problema di salute in tutto il mondo 5. Per invadere e replicarsi all'interno di una cellula di mammifero, patogeni intracellulari hanno acquisito sofisticati meccanismi di virulenza e fattori. Mentre questi meccanismi sono fondamentali per la capacità di causare una malattia, si sa poco circa la loro regolazione e la dinamica. Dal momento che i profili di espressione genica di batteri coltivate in mezzi liquidi non riflettono l'ambiente reale all'interno di cellule ospiti, vi è una crescente necessità per le analisi del trascrittoma di batteri coltivati nelle loro nicchie intracellulari. Tali analisi consentiranno la decifrazione di specifici adattamenti batteriche innescati dal conduttore e contribuiranno a identificare nuovi bersagli terapeutici per la progettazione. analisi del trascrittoma di batteri intracellulare coltivate è molto impegnativo dal momento che l'RNA dei mammiferi più numerosi RNA batterica da ATalmeno dieci volte. In questo manoscritto, descriviamo un metodo sperimentale per isolare l'RNA batterica da Listeria monocytogenes batteri che crescono all'interno delle cellule macrofagi murini. L'RNA estratto può essere usato per studiare adattamenti intracellulari e meccanismi di virulenza dei batteri patogeni di varie tecniche di analisi della trascrizione, come RT-PCR, RNA-Seq, microarray e altre tecnologie di ibridazione base.
L. monocytogenes è l'agente eziologico della listeriosi negli esseri umani, una malattia con manifestazioni cliniche di targeting principalmente individui immunocompromessi, anziani e donne incinte 6. esso è un agente patogeno intracellulare facoltativo Gram-positivi che invade una vasta gamma di cellule di mammiferi che sono stati utilizzati per decenni come un modello in interazioni ospite-patogeno studi 7. Dopo l'invasione, risiede inizialmente in un vacuolo o phagosome (nel caso delle cellule fagocitiche), da cui deve fuggire in tegli ospitare citoplasma delle cellule al fine di replicare. Diversi fattori di virulenza hanno dimostrato di mediare il processo di fuga, soprattutto l'emolisina pore-forming, listeriolysin O (LLO) e due fosfolipasi ulteriori 8. Nel citosol i batteri utilizzano macchinari polimerizzazione ospitante per spingersi sui filamenti di actina all'interno della cellula e di diffondersi da cellula a cellula (Figura 1). Tutti i principali fattori di virulenza di L. monocytogenes coinvolti nella invasione, la sopravvivenza intracellulare e la replica, vengono attivati dal regolatore di trascrizione maestro virulenza, PrfA. 8-10.
Negli ultimi dieci anni, diversi studi condotti da noi e altri hanno applicato con successo metodi per l'analisi del trascrittoma di batteri intracellulare cresciuti all'interno delle cellule ospiti 2,11-15. Due approcci principali sono utilizzati per separare l'RNA batterica da host-RNA che si basano su: 1) l'arricchimento selettivo di RNA batterico e 2) l'isolamento di RNA da diffelisi cellulare renziale. Il primo approccio si basa sulla ibridazione sottrattiva del totale estratti di RNA di molecole di RNA di mammiferi (ad esempio utilizzando kit disponibili in commercio) o la cattura selettiva di sequenze di trascritti batteriche (Scozia) 11. Il secondo approccio si basa sulla lisi differenziale di batteri e cellule ospiti, in cui le cellule ospiti vengono lisate mentre le cellule batteriche rimangono intatte. Le cellule batteriche sono poi separati dal lisato cellula ospite, di solito per centrifugazione, e l'RNA è estratto utilizzando tecniche standard. Il problema principale di questo approccio è che, insieme con i batteri intatti, cellule ospiti nuclei sono anche isolati, in tal modo i preparativi di RNA contengono ancora RNA mammiferi. Un modo per superare questo problema è quello di separare i batteri intatti da cellule ospiti nuclei mediante centrifugazione differenziale, se questa procedura richiede solitamente tempo aumentare la preoccupazione delle variazioni del profilo di espressione genica durante l'estrazione. In questo articolo presentiamo un ba migliore e rapidaprotocollo di estrazione cteria RNA, che si basa sulla differenza di cellule approccio lisi. Primo, L. monocytogenes infetti macrofagi sono lisate con acqua fredda. Successivamente, i nuclei dei macrofagi vengono rimossi da una breve centrifugazione e batteri intatti sono rapidamente raccolti su filtri, da cui l'RNA è isolato tramite hot estrazione con fenolo-SDS degli acidi nucleici batterici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo ottimizzato per l'isolamento di RNA batterico da L. monocytogenes batteri che crescono intracellulare nelle cellule macrofagi. Questo protocollo si basa su lisi differenziale cellulare e comprende due fasi principali per l'arricchimento di RNA batterico: macrofago sedimentazione nuclei mediante centrifugazione ed un rapido accumulo di batteri per filtrazione. Questi passaggi sono seguiti da un procedimento di estrazione di RNA standard. Mentre questo pro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
Riferimenti
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