マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
最近開発されたハイスループット単一細胞アッセイ技術は、新規酵素がそれらの機能的活動1に基づいて大規模な遺伝的ライブラリーからスクリーニングすることができます。単一細胞レベルで、転写を調節するタンパク質は、標的酵素活性の結果として産生される小分子を検出することによりレポーター遺伝子の発現を誘発するために使用されます。 1つの初期のアプローチは、基板がレポータータンパク質2の発現を誘導する（SIGEX）メソッドを、スクリーニング基板に誘導される遺伝子発現を使用して、 ラルストニアユートロファ E2からフェノール分解オペロンの単離を含んでいました。 シュードモナス・プチダのNhaRはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ3を選択するために使用し、 コリネバクテリウム・グルタミカムからLysGは、多様な変異体のライブラリー4から新たなL-リジン生産株のハイスループットスクリーニングに使用しました。
以前は、遺伝的酵素screeningのシステム（GESS）は、一般的に適用可能なスクリーニングプラットフォーム5として提案されました。このシステムはP.の、フェノール認識ジメチルレギュレータ、DMPRを使用していますプチダ 。 DMPR（E135K）、及びDMPRの変異体は、また、p個のニトロフェノール（PNP）を検出するためのGESS（PNP-GESS）で使用することができます。フェノール化合物を製造する標的酵素の存在下で、 大腸菌においてGESS 大腸菌細胞は、蛍光活性化セルソーター（FACS）を使用して、単一の細胞の迅速な単離を可能にする、蛍光シグナルを発します。しかし、メタゲノム酵素の発現は、従来の組換え酵素のそれよりも弱いように見えます。従って、GESS最適な運転条件5と一緒にリボソーム結合部位（RBS）とターミネーター配列との組み合わせを調査することによって最大感度を有するフェノール化合物を検出するように設計しました。
GESSの基本的な利点の一つは、この単一のメソッドは、理論的にはOVのスクリーニングを可能にすることですBRENDAデータベース内の酵素のERより200異なる種類（ 表1は、http：// www.brenda-enzymes.info、2013.7）単に異なる基板を採用することにより。これは、セルラーゼ、リパーゼ、及びメチルパラチオンヒドロラーゼ（MPH）は、それぞれのp -nitrophenyl酪酸、p個の -nitrophenyl-cellotrioside、およびメチルパラチオン、5の適切な基質でPNP-GESSを用いて検出することができることが示されました。最近では、PNP-GESSを使用して同定された新規酵素の一つであるアルカリホスファターゼ（AP）は、低温適応海洋metagenomes 6で最初に検出された熱不安定性のAPであることが判明しました。
ここでは、スクリーニングプロセスの詳細は、PNP-GESSはメタゲノムライブラリ5,6から新規候補酵素を同定する迅速enzymes-リパーゼ、セルラーゼ、およびアルカリホスファターゼの3種類の活動を検出-andが提示されます。プロセスは、PNP-GESSとオペレーティングFLとメタゲノムの前処理を含みますOWサイトメトリー選別機。得られたヒットはさらに識別のために配列決定する必要がありますが、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いて酵素活性確認の手順までの手順をカバーしています。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体触媒の生産効率を大きくすると、最高の自然な酵素源の一つと考えられている業界9とメタゲノムベースのバイオ化学の成功の鍵です。この意味で、それは、遺伝資源の大部分が10を検討されていないメタゲノムから新規酵素をスクリーニングするために不可欠です。いくつかのスクリーニング方法は、直接転写活性化因子11,12を用いた酵素生成物を検出す…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Riferimenti
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