Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Недавно был разработан с высокой пропускной способностью методикой определения одноклеточного позволяет новые ферменты , которые будут экранированы от крупномасштабной генетической библиотеки на основе их функциональной активности 1. На одном уровне клетки, белки, регулирующие транскрипцию используются, чтобы вызвать экспрессию гена-репортера путем обнаружения малых молекул, которые образуются в результате активности целевого фермента. Одним из первых подход предусматривал выделение фенола деградирующих оперона из Ralstonia eutropha Е2 с использованием субстрата индуцированной генетической экспрессии скрининг метод (SIGEX), в котором подложка индуцирует экспрессию белка – репортера 2. NhaR из Pseudomonas putida был использован для выбора бензальдегида дегидрогеназы 3 и LysG из Corynebacterium glutamicum был использован для высокопроизводительного скрининга нового L-лизин штамма из различных мутантных библиотек 4.
Ранее генетический фермент screeniСистема нг (GESS) была предложена в качестве общего применения скрининга платформы 5. Эта система использует регулятор ДИМЕТИЛФЕНОЛА фенол-распознающих, DmpR, Р. putida. DmpR (E135K), и мутант DmpR, также могут быть использованы в GESS (PnP-GESS) для обнаружения р -nitrophenol (PnP). В присутствии ферментов – мишеней , продуцирующих фенольные соединения, ГЕСС в E. палочка клетки испускает флуоресцентный сигнал, что позволяет быстрое выделение отдельных клеток с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток (FACS). Но экспрессия метагеномной фермента, как представляется, слабее, чем у обычных рекомбинантных ферментов; Таким образом, GESS был разработан для обнаружения фенольных соединений с максимальной чувствительностью, исследуя сочетание сайта связывания рибосом (RBS) и терминатор последовательностей наряду с оптимального рабочего состояния 5.
Одним из основных преимуществ GESS является то, что это единственный метод теоретически позволяет скрининг OVэр чем 200 различных типов ферментов , в базе данных Бренда (таблица 1, HTTP: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) путем простого использования различных субстратов. Было показано , что целлюлазы, липазы и метилпаратиону гидролазы (MPH) можно обнаружить с помощью ПНП-Гесс с соответствующими субстратами р нитрофенил бутирата, р – нитрофенил-cellotrioside и метилпаратиона, соответственно 5. Недавно было доказано , что щелочной фосфатазы (АР), которая является одним из новых ферментов , идентифицированных с использованием ПНП-Гесс, является первым термолабильных А.П. найден в холодоадаптированных морских метагеномов 6.
Здесь, подробная информация о процессе скрининга представлен с PnP-GESS обнаружения деятельности трех различных типов enzymes- липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы -И быстрого выявления новых кандидатов ферментов из метагеномной библиотеки 5,6. Процессы включают метагенома предварительную обработку с ПНП-GESS и эксплуатации флвл цитометрии сортировщика. В то время как полученные удары должны быть секвенированы для дальнейшей идентификации, этот протокол охватывает процедуру до шаги ферментативного подтверждения активности с использованием проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Повышение эффективности производства биокатализаторов является ключевым для успеха био-химической промышленности , основанной 9 и метагенома считается одним из лучших естественных источника фермента. В этом смысле важно скрининга новых ферментов из метагенома , где большинств…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Riferimenti
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
