Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems ^1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon ^1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel Bewegungen beeinflussen.

Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um die Wirkung der Lockstoff und abweisende Moleküle zu bewerten. Chemo-Lockstoffen und Repellentien können mit einem Gradienten – Konzentration (z. B. Dunn Kammer oder μ-Dias) ^5,6, in einer hochkonzentrierten Stelle von Mikro-p in das Wachstum / Kulturmedium verabreicht werdenipette (z. B. Drehen assay) ⁷ oder mit einer homogenen Konzentration von Badanwendung (z. B. Wachstumskegel collapse assay) ^8,9.

Andere Verfahren umfassen ein Streifentest oder Mikrokontakt- Drucken ( & mgr ; CP), in dem eine chemo-Lockstoff oder Repellent auf der Oberfläche einer Platte als Substrat ^10-12 beschichtet ist. Thestripe Test wurde ursprünglich von Bonhoeffer und Kollegen im Jahr 1987 entwickelte ¹³ topographische Kartierung in den Küken retino-tectal System zu analysieren. Die ursprüngliche Methode benötigt, um ein Vakuumsystem zur Beschichtung von Proteinen auf Polycarbonat Nukleopore Membranen mit gestreiften und vermaschten Matrizen. In späteren Versionen wurden die rekombinanten Proteine ​​auf der Oberfläche einer Kulturplatte in einem Streifenmuster mit schmalen Schlitz Silizium – Matrizen ^14,15 direkt gedruckt. In jüngster Zeit haben verschiedene Forschergruppen erfolgreich angewendet diesen Streifen – Assay auf die Analyse von Axon Führung Molekülaktivitäten ^16-21.

<p class = "jove_content"> Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für einen Streifen Assay, der die Anziehung oder Abstoßung von Axon Führung Moleküle für die dissoziierten Neuronen im Hippocampus misst. Bemerkenswert ist, kann dieses Verfahren in der minimal ausgestatteten Labor-Einstellungen angewendet werden. Für diesen Assay abwechselnde Streifen aus einem fluoreszenzmarkierten Substrat und einem Kontrollprotein sind auf einer Kunststoffschale erzeugt eine Siliciummatrix mit 90 & mgr; m Schlitzen und beschichtet mit Laminin verwenden. In unserer Demonstration, distanzierte Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen auf abwechselnden Streifen von rekombinanten Ektodomäne von Fibronektin und Leucin-reichen Transmembranprotein-2 (FLRT2) und Kontroll – Fc – Protein ²¹ kultiviert. Nach 24 h der Kultur, sowohl die Axone und Zellkörper der Neuronen wurden aus den FLRT2 Streifen stark abgestoßen. Anfärbung mit einem Antikörper anti-Tau1 ergab, dass ~ 90% der Neuronen auf der Fc-beschichteten Bereiche verteilt wurden, im Vergleich zu ~ 10% auf die FLRT2-Fc, das anzeigt, daß eine starke Abstoßungs FLRT2 hatFunktion für Neuronen im Hippocampus ^21.

Protocol

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an Hamamatsu University School of Medicine zugelassen. 1. Herstellung von Matrices Sieden 4-8 Silikon-Matrices in einer Mikrowelle oder auf einer heißen Platte für 5 min und lassen sie für 1 h unter laminaren Strömungs (striped Seite nach oben) vollständig trocknen. Hinweis: Die folgenden Verfahren sollten unter laminaren Strömung durchgeführt werden. Preßluft oder verwen…

Representative Results

Dissociated Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen wurden plattiert und für 24 h auf Streifen von fluoreszenzmarkierten Kontroll – Fc (3A-C) oder FLRT2-Fc (3D-F) mit nicht-markierten Kontroll – Fc abwechseln. In beiden Fällen waren die Neuronen aggregiert und erweitert ihre Axone als Bündel. Auf der Kontroll – Fc / Fc Streifen wurden die Neuronen gleichmäßig auf die fluoreszenzmarkierten und nicht-markierten Streifen verteilt, und sie erweitert i…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Streifen Assay, rekombinantes Protein und dissoziierte Neuronen aus dem Hippocampus E15.5 Maus verwendet. Dieser Assay ermöglicht die effiziente Beobachtung repulsive, attraktiv, oder neutrale Antworten von Neuronen auf ein rekombinantes Protein von Interesse in einem gestreiften Muster angeordnet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die einfache Methode für die Streifen zu erzeugen, in dem das Protein direkt auf die Oberfläche einer Kunststoffschale aufgedruckt ist, im Ve…

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.