ストライプアッセイは、解離海馬ニューロンを用いたタンパク質基質の魅力や反発作用を検討します
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
軸索ガイダンスは、新たに形成された神経細胞は、神経系1,2の開発中に彼らのターゲットに軸索を送信するプロセスです。開発軸索は、成長円錐と呼ばれる彼らの先端で非常に運動性の構造を運びます。成長円錐は軸索のパスをナビゲートするために、細胞外の合図を感知します。ガイダンスのようなスリット、セマフォリンのような分子、およびエフリンは、誘致や軸索1,3,4上の適当な受容体及び共受容体との相互作用に応じて軸索を撃退することができます。活性化受容体は軸索と成長円錐の運動のために、その細胞骨格の組織に影響を与える成長円錐に信号を転送します。
様々な方法が誘引と忌避分子の作用を評価するために開発されてきました。化学誘引物質及び忌避剤は、濃度勾配と成長/培養液中に投与することができる（ 例えば 、ダンのチャンバまたはμ-スライド）マイクロpで高度に濃縮されたスポットで5,6、ipette（ 例えば 、旋回アッセイ）7またはバスのアプリケーション（ 例えば 、成長円錐崩壊アッセイ）8,9により均質な濃度で。
他の方法は、化学誘引または忌避剤は、基板10〜12のように板の表面に塗布されたストライプアッセイまたはマイクロコンタクト印刷（μCP）が挙げられます。 Thestripeアッセイは、もともとひよこレチノ-tectalシステム13内の地形図のマッピングを分析するために1987年にボンヘッファーらによって開発されました。元のメソッドは、ストライプと噛み合っ行列を使用して、ポリカーボネートのNucleoporeメンブレンにコートタンパク質への真空システムを必要としました。以降のバージョンでは、組換えタンパク質を直接狭いスリットシリコンマトリックス14,15を使用してストライプ状に培養プレートの表面に印刷しました。近年、様々な研究グループが成功した軸索ガイダンス分子の活動16-21の分析にこのストライプアッセイを適用しています。
<p class = "jove_contentは">ここでは、解離した海馬ニューロンのための軸索ガイダンス分子の引力や反発力を測定ストライプアッセイのための詳細なプロトコルを提示します。注目すべきことに、この方法は、最小装備の実験室の設定で適用することができます。このアッセイでは、蛍光標識された基質および対照タンパク質の交互のストライプは、90ミクロンのスリットを有するシリコンマトリクスを使用してプラスチック皿に生成され、ラミニンでコーティングしました。私たちのデモでは、E15.5マウス由来の海馬ニューロンは、フィブロネクチンの組換え細胞外ドメインおよびロイシンリッチ膜貫通タンパク質-2（FLRT2）のストライプを交互にし、Fcタンパク質21を制御する上で培養した解離しました。培養の24時間後に、軸索及びニューロンの細胞体の両方が強くFLRT2ストライプから反発しました。抗TAU1抗体で染色すること〜ニューロンの90％がFLRT2は強い反発があることを示す、FLRT2-Fc上の約10％と比較して、Fcをコーティングした領域上に分布していたことを明らかにしました海馬神経細胞21のための機能。Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、E15.5マウス海馬から組換えタンパク質および解離ニューロンを使用してストライプアッセイを説明します。このアッセイは、ストライプ状に配置された目的の組換えタンパク質に対するニューロンの、反発魅力的、または中立的応答の効率的な観察を可能にします。このプロトコルの主な利点は、特別な行列、真空システムを必要とする従来の方法に比較して、タンパク?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
Riferimenti
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