Stripe-analyse for å studere attraktiv eller frastøtende aktivitet av et protein underlaget med Spaltet hippocampus nevroner

Summary

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.

Abstract

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Introduction

Axon veiledning er prosessen der nydannede nerveceller sender aksoner til deres mål under utviklingen av nervesystemet ^1,2. Utvikling aksoner bære en svært bevegelige struktur på sine tips kalt vekst kjegle. Veksten kjegle sanser ekstracellulære signaler for å navigere i axon bane. Veiledning molekyler, slik som slit, semaphorin og ephrins, kan tiltrekke eller frastøte axoner avhengig av deres interaksjon med egnede reseptorer og co-reseptorer på aksonet ^1,3,4. De aktiverte reseptorene overfører signaler til veksten kjegle som påvirker dens cytoskeletal organisasjon for axon og vekst-membran bevegelser.

Forskjellige fremgangsmåter har blitt utviklet for å evaluere virkningen av tiltrekkende og avstøtende molekyler. Chemo-lokkemidler kan bli administrert til vekst / kulturmedium med en gradient konsentrasjon (f.eks., Dunn kammer eller u-sklier) ^5,6, i en meget konsentrert flekk ved mikro-pipette (f.eks., snu assay) ⁷ eller ved en homogen konsentrasjon av bad program (f.eks., vekst kjegle kollaps analyse) ^8,9.

Andre fremgangsmåter innbefatter en stripe assay eller mikrokontakttrykking (μCP), i hvilken en chemo-tiltrekkende eller frastøtende belegges på overflaten av en plate som et substrat ^10-12. Thestripe analysen ble opprinnelig utviklet av Bonhoeffer og kolleger i 1987 for å analysere topografisk kartlegging i dama Retino-tectal system ^13. Den opprinnelige metode kreves et vakuumsystem for å kappeproteiner på polykarbonatmembraner ved hjelp av Nucleopore stripet og stormasket matriser. I senere versjoner, ble de rekombinante proteinene direkte trykt på overflaten av en kulturplate i et stripet mønster ved hjelp av smal spalte silisium matriser ^14,15. Nylig har ulike forskningsgrupper med hell brukt denne stripe analyse til analyse av axon veiledning molekyl aktiviteter ^16-21.

<p class = "jove_content"> Her presenterer vi detaljert protokoll for en stripe metode som måler tiltrekningen eller frastøting av axon veiledning molekyler for dissosiert hippocampus nevroner. Spesielt, kan denne fremgangsmåte anvendes i minimal utstyrt laboratoriet. For denne analyse blir alternerende striper av et fluorescensmerket substrat og et kontrollprotein som genereres på en plastskål ved hjelp av en silisium-matrise med 90-um spalter og belagt med laminin. I vår demonstrasjon, dissosiert hippocampus nerveceller fra E15.5 mus ble dyrket på alternerende striper av rekombinant ectodomain av fibronektin og leucine-rik trans protein-2 (FLRT2) og kontrollere Fc protein ^21. Etter 24 timer med kultur, ble både axoner og celle likene av nevroner sterkt frastøtt fra FLRT2 striper. Farging med et anti-Tau1-antistoff viste at ~ 90% av nevronene ble fordelt på Fc-belagte områder, sammenlignet med ~ 10% på den FLRT2-Fc, noe som indikerer at FLRT2 har et sterkt frastøtendefunksjon for hippocampus nevroner ^21.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Hamamatsu University School of Medicine. 1. Utarbeidelse av matriser Kok 4-8 ​​silikon matriser i mikrobølgeovn eller på en varm plate for 5 min og la dem tørke helt i 1 time under laminær (stripete siden opp). Merk: Følgende prosedyrer skal utføres under laminær. Blås trykkluft eller bruke tapen for å fjerne støv fra den stripete siden av matriser. Hold stripete side re…

Representative Results

Dissosierte hippocampale nerveceller fra E15.5 mus ble sådd ut og dyrket i 24 timer på striper av fluorescensmerkede kontroll Fc (Figur 3A-C) eller FLRT2-Fc (Figur 3D-F) som alternerer med ikke-merket kontroll Fc. I begge tilfeller nervecellene var samlet og utvidet sine aksoner som bunter. På kontroll Fc / Fc striper, nervecellene ble fordelt jevnt på fluorescensmerkede og ikke-merkede striper, og de ​​utvidet sine axoner i tilfeldige retninger …

Discussion

Denne protokollen beskriver en stripe analysen som bruker rekombinant protein og dissosiert nevroner fra E15.5 mus hippocampus. Denne analysen tillater effektiv observasjon av frastøtende, attraktive, eller nøytrale responsene til neuroner til et rekombinant protein av interesse plasseres i et stripet mønster. En stor fordel med denne protokollen er den enkle metode for generering av striper, hvori proteinet er direkte trykt på overflaten av en plastskål, sammenlignet med den tradisjonelle metode, som krever særsk…

Materials

15 mL centrifuge tube	Violamo	1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai	01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody	Thermo Scientific	A-21203	Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody	Chemicon	MAB3420	Dilution 1/200
Antifade	Thermo Scientific	P7481	Alternative mounting media may be used
B27 supplement	Thermo Scientific	17504-044	Dilution 1/50
Bovine serum albumin	Sigma	01-2030-2
Cell strainer 100 um	BD Falcon	352360
Centrifugation machine	Kubota	2410
Cover glass 18mmx18mm	Matsunami	18×18 mm No. 1
DAKO pen	DAKO	S2002	Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel	Feather	2975#11
FBS	Thermo Scientific	10437-028
Fluorecent microscope	Nikon	E600
Forceps No. 5	Fine Science Tools	11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050-061	Dilution 1/200
Hamilton Syringe	Hamilton	805N	22 gauge, 50 uL
HBSS	Thermo Scientific	14170-112
Human IgG, Fc Fragment	Jackson	009-000-008
Laminin	Thermo Scientific	23017-015
Neurobasal	Thermo Scientific	21103-049
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
PBS	Nacalai	14249-24
Penicillin-Streptomycin	Thermo Scientific	15070-063	Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Silicone Matrices			Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Tip, 1000 uL	Watson	125-1000S
Transparent sticky tape	Tesa	57315	Alternative sticky tape may be used
Triton X-100	Sigma	T8787
Trypan blue, 0.4%	Bio-Rad	145-0013
Trypsin/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Culture medium			Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.