Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso 1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón 1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimientos de los axones y el crecimiento de cono.
Varios métodos han sido desarrollados para evaluar la acción de las moléculas de atrayentes y repelentes. Quimio-atrayentes y repelentes se pueden administrar en el medio de crecimiento / cultivo con una concentración de gradiente (por ejemplo., La cámara de Dunn o Mu diapositivas) 5,6, en un lugar muy concentrada por micro-pipette (por ejemplo., ensayo de torneado) 7 o a una concentración homogénea mediante la aplicación de baño (por ejemplo., el ensayo de colapso del cono de crecimiento) 8,9.
Otros métodos incluyen un ensayo de raya o impresión por microcontacto (μCP), en la que se recubre una quimio-atrayente o repelente en la superficie de una placa como sustrato 10-12. Thestripe ensayo fue desarrollado originalmente por Bonhoeffer y sus colegas en 1987 para analizar la cartografía topográfica en el sistema retino-chick tectal 13. El método original requiere un sistema de vacío para proteínas de la cubierta en las membranas de policarbonato Nucleopore utilizando matrices de rayas y malladas. En versiones posteriores, las proteínas recombinantes fueron impresos directamente sobre la superficie de una placa de cultivo en un patrón de rayas utilizando matrices de silicio estrecha rendija 14,15. Recientemente, varios grupos de investigación han aplicado con éxito este ensayo de franja en el análisis de las actividades de moléculas de orientación axón 16-21.
<p class = "jove_content"> A continuación, presentamos el protocolo detallado para un ensayo que mide la raya de la atracción o repulsión de moléculas de orientación axón de las neuronas del hipocampo disociadas. Cabe destacar que este método se puede aplicar en el laboratorio mínimamente equipadas. Para este ensayo, se alternan franjas de un sustrato marcado con fluorescencia y una proteína de control se generan en un plato de plástico utilizando una matriz de silicio con rendijas 90-M y recubiertas con laminina. En nuestra demostración, disociados de neuronas del hipocampo de ratones E15.5 se cultivaron en rayas de ectodominio recombinante de fibronectina y rica en leucina proteína transmembrana-2 (FLRT2) y controlar proteína Fc 21 alterna. Después de 24 h de cultivo, tanto los axones y cuerpos celulares de las neuronas estaban fuertemente repelidos de las rayas FLRT2. La tinción con un anticuerpo anti-TAU1 reveló que ~ 90% de las neuronas se distribuyeron en las regiones Fc recubierto, en comparación con ~ 10% en el FLRT2-Fc, lo que indica que FLRT2 tiene una fuerte repulsiónfunción de las neuronas del hipocampo 21.Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparació…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
PBS | Nacalai | 14249-24 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |