Rand analys för att studera Attraktiv eller frånstötande aktivitet av en proteinsubstrat Använda Dissocierad hippocampus nervceller
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
Axon vägledning är den process genom vilken nybildade nervceller skickar axoner till sina mål under utvecklingen av nervsystemet 1,2. U-axoner bär en mycket motila struktur vid sin spets kallas tillväxten konen. Tillväxten konen känner extracellulära signaler att navigera axonet väg. Väglednings molekyler, såsom slitsen, semaforin och ephrins, kan attrahera eller repellera axoner beroende på deras interaktion med lämpliga receptorer och co-receptorer på axonet 1,3,4. De aktiverade receptorer överför signaler till tillväxten konen som påverkar dess cytoskelettala organisation för axon och tillväxt kon rörelser.
Olika metoder har utvecklats för att utvärdera verkan av lockmedel och repellerande molekyler. Kemo-attraherande och repellerande medel kan administreras i tillväxten / odlingsmedium med en gradient koncentration (eg., Dunn kammare eller | i-slides) 5,6, i en högkoncentrerad plats av mikro-pipette (eg., svarvning analys) 7 eller en homogen koncentration av bad ansökan (eg., tillväxten konen kollaps analys) 8,9.
Andra metoder inkluderar en rand analys eller mikrokontakttryckning (μCP), i vilken en kemo-attraherande eller bortstötande beläggs på ytan av en platta som ett substrat 10-12. Thestripe analys utvecklades ursprungligen av Bonhoeffer och kollegor i 1987 för att analysera topografisk kartläggning i chick Retino-tectal systemet 13. Den ursprungliga metoden krävs ett vakuumsystem för att belägga proteiner på polykarbonat Nucleopore membran med hjälp av randiga och nät med matriser. I senare versioner, var de rekombinanta proteinerna är direkt tryckt på ytan av en odlingsplatta i ett randigt mönster med hjälp av smala slitskiselmatriserna 14,15. Nyligen har olika forskargrupper framgångsrikt tillämpat denna rand analys till analys av Axon vägledning molekyl aktiviteter 16-21.
<p class = "jove_content"> Här presenterar vi den detaljerade protokoll för en rand analys som mäter attraktion eller repulsion av Axon vägledning molekyler för dissocierade hippocampus neuroner. Notably, kan denna metod tillämpas i minimalt utrustade laboratoriemiljö. För denna analys är alternerande ränder av en fluorescensmärkt substrat och ett kontrollprotein genererats på en plastskål med användning av en kiselmatris med 90-fim slitsar och belades med laminin. I vår demonstration, skiljas hippocampus neuroner från E15.5 möss odlades på alternerande ränder av rekombinant ektoområde av fibronektin och leucin-rika transmembranproteinet-2 (FLRT2) och kontroll-Fc-protein 21. Efter 24 h odling, var både axoner och cellkropparna av nervceller kraftigt repelleras från FLRT2 ränder. Färgning med en anti-Tau1 antikropp avslöjade att ~ 90% av neuronerna var fördelade på Fc-belagda regioner, jämfört med ~ 10% på FLRT2-Fc, vilket indikerar att FLRT2 har en stark motbjudandefunktion för hippocampala neuroner 21.Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en rand analys som använder rekombinant protein och dissocierade neuroner från E15.5 mus hippocampus. Denna analys gör det möjligt att effektivt observation av motbjudande, attraktiva, eller neutrala svar av nervceller till ett rekombinant protein av intresse placeras i ett randigt mönster. En stor fördel med detta protokoll är den enkla metoden för att generera ränderna, där proteinet är direkt tryckta på ytan av en plastskål, jämfört med den traditionella metoden, som kräver s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
Riferimenti
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -. l., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -. j., Poo, M. -. m. Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
