Nova abordagem para gravação simultânea da atividade do nervo simpático Renal e pressão arterial com infusão intravenosa em consciente, ratos desenfreados.
Summary
Ratos anestesiados exibem não-fisiológicos pressão arterial sistêmica, que impede a avaliação significativa do tônus autonômico, dada a íntima relação entre a pressão arterial e o sistema nervoso autônomo. Assim, um método novo para a atividade do nervo simpático renal simultaneamente recorde e a pressão arterial com infusão intravenosa em ratos conscientes é descrito.
Abstract
Nervos simpáticos renais contribuem significativamente para fenômenos fisiológicos e fisiopatológicos. Avaliar a atividade do nervo simpático renal (RSNA) é de grande interesse em muitas áreas de pesquisa, tais como a doença renal crônica, hipertensão arterial, insuficiência cardíaca, diabetes e obesidade. Avaliação inequívoca do papel do sistema nervoso simpático, portanto, é imperativa para a adequada interpretação dos resultados experimentais e compreensão dos processos da doença. RSNA tem sido tradicionalmente medido em roedores anestesiados, incluindo ratos. No entanto, os ratos geralmente apresentam muito baixa pressão arterial sistêmica e instabilidade hemodinâmica durante várias horas durante anestesia e cirurgia. Interpretação significativa do RSNA é confundida por este estado de não-fisiológicas, dado a relação íntima entre tônus nervoso simpático e o estado cardiovascular. Para resolver essa limitação das abordagens tradicionais, desenvolvemos um novo método para medir a RSNA em ratos conscientes, movimentando-se livremente. Os ratos foram instrumentados cronicamente com radio-sensores para monitoramento contínuo da pressão arterial, bem como um cateter de infusão venosa jugular e eletrodo bipolar personalizados para gravação directa da RSNA. Após um período de recuperação de 48-72 horas, a taxa de sobrevivência foi de 100% e todos os ratos se comportou normalmente. Neste ponto de tempo, RSNA foi gravado com sucesso em 80% dos ratos, com sinais viáveis adquiridos até 4 e 5 dias pós cirurgia em 70% e 50% dos ratos, respectivamente. Fisiológicos de pressão arterial foram registrada em todos os mouses (116±2 mmHg; n = 10). RSNA gravado aumentado com comendo e de aliciamento, tão bem estabelecida na literatura. Além disso, RSNA foi validado pelo bloqueio ganglionar e modulação da pressão arterial com agentes farmacológicos. Neste documento, um método eficaz e gerenciável para gravação clara do RSNA em camundongos conscientes, movimentando-se livremente é descrito.
Introduction
Interesse em utilizar ratos em diversas áreas de investigação biomédica continua a expandir-se com o desenvolvimento de inúmeros modelos geneticamente modificados. Na maior parte, os avanços técnicos tem acompanhado o aumento do uso de ratos em fisiologia e agora há uma impressionante selecção de dispositivos miniaturizados, desenvolvido especificamente para medir parâmetros fisiológicos importantes em camundongos. Embora direto de dispositivos de telemetria para medição de autonômica Tom nervoso no rato consciente foram disponíveis para mais de uma década, dispositivos miniaturizados para avaliar a atividade do nervo em camundongos conscientes não estão atualmente disponíveis. Os investigadores tipicamente contornar essa limitação, avaliando a contribuição do sistema nervoso autônomo com métodos indirectos (ou seja, plasma ou urina de catecolaminas, bloqueio autonômico farmacológico, análise espectral dos padrões de sangue pressão/pulsação)1.
Enquanto essas abordagens fornecem informações valiosas, o resultado é uma imagem global do tom geral autonômica, ao invés de revelar a contribuição discreta de populações isoladas dos nervos para o fenômeno sob investigação. Alternativamente, direto da gravação da atividade dos nervos específicos foi executado em ratos anestesiados, que constitui uma infinidade de preocupações. É extremamente difícil de manter estável pressão de sangue dentro da faixa fisiológica em um rato anestesiado por várias horas após a cirurgia. Na verdade, esses tipos de experimentos, pressão arterial é muitas vezes não declarada ou apresentado em níveis extremamente baixos (ou seja, 60-80 mmHg vs > 100mmHg em um rato consciente)2. A fragilidade do sistema cardiovascular exibida em preparação um rato anestesiados muitas vezes impede a avaliação significativa da atividade do nervo autonômico, dada a relação de co-dependência entre pressão arterial e tônus simpático3, 4.
Para resolver essa limitação, um novo método para gravação directa da atividade do nervo simpático renal (RSNA) em consciência, ratos desenfreados, imperturbados dentro de suas gaiolas para casa foi desenvolvido. Tanto a abordagem cirúrgica e experimental para o sucesso da implementação dessa técnica é descrita em detalhe. Esta preparação permite que o investigador gravar simultaneamente a pressão arterial através de radiotelemetria além RSNA, com a capacidade adicional de infundir por via intravenosa agentes turísticos sem perturbar o mouse.
Vinte e quatro horas depois da cirurgia, comportar-se normalmente de ratos e não apresentam sinais de dor ou sofrimento. Experimentais gravações então podem começar pós-operatório de 48 a 72 horas, enquanto o mouse repousa confortavelmente em sua gaiola em casa, com acesso irrestrito à comida, água e enriquecimento ambiental. Clara RSNA traços são apresentados e as respostas características desta população de nervo a movimentos físicos normais do animal (tais como comer e grooming) são demonstradas além de modulação farmacológica da pressão arterial sistêmica. A qualidade e a especificidade do sinal RSNA mais é validada pelo bloqueio ganglionar. Este manuscrito inclui o complemento audiovisual para uma descrição inicialmente publicada esta técnica5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui temos descrito, demonstrado e validado um método novo para avaliação orientada do RSNA em ratos conscientes, livres para mover-se e descansar confortavelmente em suas gaiolas para casa. Após a implantação cirúrgica de um radiotelemeter de pressão arterial, um cateter de infusão intravenosa permanente e um eletrodo bipolar personalizados do RSNA, ratos recuperaram da cirurgia e foram deixados sem ser perturbado por 48 a 72 horas. Camundongos permaneceram confortavelmente estabelecidos em sua gaiola em casa e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.M.H. foi apoiado por bolsas de pós-doutorado dos institutos canadenses para pesquisa de saúde (CIHR), coração & Stroke Foundation do Canadá (HSFC) e Alberta inova saúde soluções (AiHS); J.E.H. é suportado por um fundo de nacional de coração, pulmão e sangue Instituto PO1HL-51971.
Materials
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
Riferimenti
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, d. a., A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri, ., Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O’Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
