Nuevo enfoque para la grabación simultánea de la actividad nerviosa simpática Renal y presión arterial con la infusión intravenosa en consciente, libre de ratones.
Summary
Ratones anestesiados exhiben la presión arterial sistémica no fisiológico, que impide una evaluación significativa del tono autonómico, dada la íntima relación entre la presión arterial y el sistema nervioso autónomo. Así, se describe un método novedoso para la actividad del nervio simpático renal al mismo tiempo récord y la presión arterial con la infusión intravenosa en ratones conscientes.
Abstract
Los nervios simpáticos renales contribuyen significativamente a los fenómenos fisiológicos y patofisiológicos. Evaluación de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) es de gran interés en muchas áreas de investigación tales como la enfermedad renal crónica, hipertensión, insuficiencia cardíaca, diabetes y obesidad. Evaluación inequívoca del papel del sistema nervioso simpático así es imprescindible para la correcta interpretación de resultados experimentales y la comprensión de procesos de la enfermedad. RSNA ha sido tradicionalmente medida en roedores anestesiados, incluyendo ratones. Sin embargo, ratones generalmente exhiben muy baja la presión arterial sistémica e inestabilidad hemodinámica durante varias horas durante la anestesia y la cirugía. Interpretación significativa de RSNA es confundido por esta situación no fisiológica, dada la íntima relación entre tono nervioso simpático y el estado cardiovascular. Para hacer frente a esta limitación de los enfoques tradicionales, hemos desarrollado un nuevo método para medir la RSNA en ratones conscientes, moviéndose libremente. Ratones fueron crónicamente instrumentados con radio telemetría para monitoreo continuo de presión arterial, así como un catéter de infusión venosa yugular y electrodo bipolar diseñado para la grabación directa de RSNA. Después de un período de recuperación de 48-72 horas, la tasa de supervivencia fue del 100% y todos los ratones se comportaban normalmente. En este momento, RSNA se registró con éxito en el 80% de los ratones, con las señales viables adquiridas hasta 4 y 5 días post-cirugía en 70% y el 50% de los ratones, respectivamente. Fisiológica presión arterial se registraron en todos los ratones (116±2 mmHg; n = 10). RSNA registrado aumentó con comer y aseo personal, tan bien establecido en la literatura. Además, RSNA fue validado por bloqueo ganglionar y la modulación de la presión arterial con agentes farmacológicos. En este documento, se describe un método eficaz y manejable para registro claro de RSNA en ratones conscientes, moviéndose libremente.
Introduction
Interés en el uso de ratones en varias áreas de la investigación biomédica continúan expandiéndose con el desarrollo de innumerables modelos genéticamente. En su mayor parte, avances técnicos han mantenido a la par con el aumento del uso de ratones en fisiología y ahora es una impresionante selección de dispositivos miniaturizados desarrollado específicamente para la medición de parámetros fisiológicos importantes en ratones. Aunque dispositivos telemétricos para dirigen medidas de autonómica tono nervioso en ratas conscientes han estado disponibles por más de una década, dispositivos miniaturizados para la evaluación de la actividad nerviosa en ratones conscientes no están disponibles actualmente. Los investigadores suelen eluden esta limitación mediante la evaluación de la contribución del sistema nervioso autónomo con métodos indirectos (es decir, catecolaminas en plasma u orina, farmacológica bloqueo autonómico, análisis espectral de los patrones de sangre presión/pulso)1.
Mientras que estos métodos proporcionan información valiosa, el resultado es una imagen global del tono autonómico en general, en lugar de revelar la discreta contribución de las poblaciones aisladas de los nervios para el fenómeno bajo investigación. También puede grabar directamente de la actividad de nervios específicos ha sido ejecutado en ratones anestesiados, que plantea una multitud de preocupaciones. Es sumamente difícil mantener estable la presión arterial dentro del rango fisiológico en un ratón anestesiado durante varias horas después de la cirugía. De hecho, en estos tipos de experimentos, la presión arterial es a menudo no denunciada o presentada en niveles extremadamente bajos (es decir, 60-80 mmHg vs > 100mmHg en un ratón consciente)2. La fragilidad del sistema cardiovascular en una preparación de ratón anestesiado a menudo excluye la evaluación significativa de la actividad del sistema nervioso autónomo, dada la relación codependiente entre presión arterial y el tono simpático3, 4.
Para hacer frente a esta limitación, un nuevo método para grabar directamente de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) en consciente, ratones desenfrenados, imperturbados dentro de sus jaulas hogar fue desarrollado. Tanto el enfoque experimental y quirúrgico para la exitosa implementación de esta técnica se describe en detalle. Esta preparación permite que el investigador registrar simultáneamente la presión arterial mediante radiotelemetría además de RSNA, con la capacidad añadida a infundir por vía intravenosa agentes de interés sin molestar el ratón.
Veinticuatro horas después de la cirugía, ratones se comportan normalmente y no presentan signos de dolor o angustia. Grabaciones experimentales pueden inicia la cirugía después de 48 a 72 horas mientras el ratón descansa cómodamente en su casa jaula con acceso ilimitado a alimentos, agua y enriquecimiento ambiental. Se presentan claras huellas RSNA y las respuestas características de esta población del nervio normales movimientos físicos del animal (por ejemplo, comer y aseo personal) se demuestran además de modulación farmacológica de la presión arterial sistémica. La calidad y la especificidad de la señal RSNA está más validado por bloqueo ganglionar. Este manuscrito incluye el complemento audiovisual a una descripción publicado al principio de esta técnica5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos esbozado, demostrado y validado un nuevo método para la evaluación específica de RSNA en ratones conscientes, libres para moverse y descansar cómodamente en sus jaulas hogar. Después de la implantación quirúrgica de una radiotelemeter de la presión arterial, un catéter de infusión intravenosa permanente y un electrodo RSNA bipolar diseñado, ratones se recuperaron de la cirugía y quedaron inalterados durante 48 a 72 horas. Ratones permanecieron cómodamente asentados en su casa jaula en todo moment…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.M.H. fue apoyado por becas postdoctorales de los institutos canadienses para investigación de la salud (CIHR), corazón & Fundación tiempos de Canada (HSFC) y Alberta Innova Health Solutions (AiHS); J.E.H. es apoyado por una donación del corazón nacional, pulmón y sangre Instituto PO1HL-51971.
Materials
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
Riferimenti
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