Nuovo approccio per la registrazione simultanea di attività simpatica renale del nervo e pressione del sangue con l'infusione endovenosa in consapevole, topi sfrenati.
Summary
Topi anestetizzati mostrano non-fisiologica pressione arteriosa sistemica, che preclude una valutazione significativa del tono autonomo dato l’intima relazione tra pressione sanguigna e il sistema nervoso autonomo. Così, è descritto un metodo novello per attività simpatica renale contemporaneamente record del nervo e pressione del sangue con l’infusione endovenosa in topi coscienti.
Abstract
Nervi simpatici renali contribuiscono notevolmente a fenomeni sia fisiologici e patofisiologici. Valutazione attività renale del nervo simpatico (RSNA) è di grande interesse in molti settori della ricerca, come la malattia renale cronica, ipertensione, insufficienza cardiaca, diabete e obesità. Inequivocabile valutazione del ruolo del sistema nervoso simpatico è dunque indispensabile per una corretta interpretazione dei risultati sperimentali e la comprensione dei processi di malattia. RSNA è stato tradizionalmente misurato nei roditori anestetizzati, tra cui topi. Tuttavia, topi esibiscono solitamente molto bassa pressione arteriosa sistemica e instabilità emodinamica per diverse ore durante l’anestesia e la chirurgia. Interpretazione significativa del RSNA è confuso da questo stato non-fisiologica, dato l’intimo rapporto tra tono nervoso simpatico e stato cardiovascolare. Per risolvere questa limitazione degli approcci tradizionali, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la misurazione RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi. Topi cronicamente sono stati strumentati con radio-telemetri per il monitoraggio continuo della pressione arteriosa come pure un catetere di infusione venosa giugulare ed elettrodo bipolare personalizzati per la registrazione diretta di RSNA. A seguito di un periodo di recupero di 48-72 ore, il tasso di sopravvivenza era al 100% e tutti i topi si sono comportati normalmente. A questo punto di tempo, RSNA è stato registrato con successo nell’80% dei topi, con segnali vitali acquisiti fino a 4 e 5 giorni dopo l’intervento in 70% e il 50% dei topi, rispettivamente. Pressione fisiologica di sangue sono stata registrata in tutti i topi (116±2 mmHg; n = 10). RSNA registrato aumentato con mangiare e governare, come affermato nella letteratura. Inoltre, RSNA è stato convalidato da blocco gangliare e modulazione di pressione sanguigna con agenti farmacologici. Qui, è descritto un metodo efficace e gestibile per la registrazione libera di RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi.
Introduction
Interesse nel usando topi in diverse aree della ricerca biomedica continua ad espandersi con lo sviluppo di innumerevoli modelli geneticamente. Per la maggior parte, progressi tecnici hanno tenuto il passo con l’uso aumentato dei topi in fisiologia e ora c’è un’impressionante selezione di dispositivi miniaturizzati, sviluppato specificamente per la misurazione di parametri fisiologici importanti nei topi. Anche se telemetriche dispositivi per la misura di autonomica diretta tono nervoso nel ratto cosciente sono stati disponibili per oltre un decennio, dispositivi miniaturizzati per valutare l’attività del nervo in topi coscienti non sono attualmente disponibili. Gli investigatori in genere aggirare questa limitazione valutando il contributo del sistema nervoso autonomo con metodi indiretti (cioè le catecolammine del plasma o nelle urine, blocco farmacologico autonomico, analisi spettrale dei reticoli di sangue pressione/pulsazioni)1.
Mentre questi metodi forniscono preziose informazioni, il risultato è un quadro globale di tono nel complesso autonomo, piuttosto che rivelare il discreto contributo di popolazioni isolate dei nervi al fenomeno in esame. In alternativa, registrazione diretta delle attività dai nervi specifici è stato eseguito in topi anestetizzati, che pone una moltitudine di preoccupazioni. È estremamente difficile mantenere stabile la pressione sanguigna all’interno della gamma fisiologica in un mouse anestetizzato per diverse ore dopo chirurgia. Infatti, in questi tipi di esperimenti, la pressione sanguigna è spesso non dichiarata o presentata a livelli estremamente bassi (cioè 60-80 mmHg contro > 100 mmHg in un mouse cosciente)2. La fragilità del sistema cardiovascolare ha esibito in una preparazione del mouse anestetizzati spesso osta ad una valutazione significativa di attività autonoma del nervo, dato il rapporto codipendente fra pressione sanguigna e del tono simpatico3, 4.
Per risolvere questa limitazione, un nuovo metodo per la registrazione diretta di attività simpatica renale del nervo (RSNA) in consapevole, topi sfrenati, indisturbati all’interno della loro casa gabbie è stato sviluppato. Sia l’approccio chirurgico e sperimentale per la corretta implementazione di questa tecnica è descritta in dettaglio. Questa preparazione consente al ricercatore di registrare simultaneamente la pressione arteriosa tramite radiotelemetria oltre ai RSNA, con in più la capacità di infondere per via endovenosa agenti di interesse senza disturbare il mouse.
Ventiquattro ore post-chirurgia, topi si comportano normalmente e non presentano segni di dolore o angoscia. Le registrazioni sperimentali possono quindi iniziare 48-72 ore successive post-all’intervento mentre il mouse si riposa comodamente nella sua gabbia a casa con accesso illimitato a cibo, acqua e arricchimento ambientale. Cancella le tracce RSNA sono presentate e le risposte caratteristiche di questa popolazione di nervo ai movimenti normali fisici dell’animale (come mangiare e governare) sono dimostrate oltre alla modulazione farmacologica della pressione arteriosa sistemica. La qualità e la specificità del segnale RSNA è ulteriormente convalidato dal blocco gangliare. Questo manoscritto contiene il complemento audiovisivo per una descrizione inizialmente pubblicato di questa tecnica5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo delineato, ha dimostrato e convalidato un metodo novello per la valutazione mirato del RSNA in topi coscienti, liberi di muoversi e di riposare comodamente nelle loro gabbie di casa. A seguito di impianto chirurgico di un radiotelemeter di pressione arteriosa, un catetere di infusione endovenosa e un design personalizzato elettrodo bipolare RSNA, topi recupero da un intervento chirurgico e sono stati lasciati indisturbati per 48-72 ore. Topi è rimasto comodamente depositati nella loro gabbia a casa in ogni m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.M.H. è stato sostenuto da borse di studio post-dottorati dal istituti canadesi per Health Research (CIHR), Heart & Stroke Foundation del Canada (HSFC) e Alberta Innova Health Solutions (AiHS); J.E.H. è sostenuta da una sovvenzione dal National Heart, Lung and sangue Istituto PO1HL-51971.
Materials
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
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