Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken
Summary
Hier wordt een originele experimentele opstelling voor het verwarmen van cellen in een cultuurschotel met behulp van 1,94 μm continu-wave laserstraling geïntroduceerd. Met behulp van deze methode kunnen de biologische reacties van retinale pigmentepitheliale cellen (RPE) na verschillende thermische blootstellingen worden onderzocht.
Abstract
Hier wordt een originele methode voor het verwarmen van gekweekte cellen met behulp van een 1,94 μm continu-golf thuliumlaser voor biologische beoordeling. Thulium laserstraling wordt sterk geabsorbeerd door water en de cellen aan de onderkant van de kweekschotel worden verwarmd door thermische diffusie. Een laservezel met een diameter van 365 μm is ongeveer 12 cm boven de kweekbak geplaatst, zonder optica, zodat de laserbundeldiameter bijna gelijk is aan de binnendiameter van de kweekschotel (30 mm). Door in elk experiment een consistente hoeveelheid kweekmedium te houden, is het mogelijk om de cellen te irradieren met een zeer reproduceerbare temperatuurverhoging.
Om de temperatuurverhoging en de verdeling ervan in één celcultuurschotel te kalibreren voor elke vermogensinstelling, werd de temperatuur gedurende 10 seconden bestraald bij verschillende posities en op het cellulaire niveau. De temperatuurverdeling werd weergegeven met behulp van een wiskundige grafische softwareProgramma, en het patroon over de cultuurschotel was in Gaussische vorm. Na laserbestraling kunnen verschillende biologische experimenten worden uitgevoerd om temperatuurafhankelijke celreacties te beoordelen. In dit manuscript wordt levensvatbaarheidsverf ( dwz onderscheiden van levende, apoptotische en dode cellen) geïntroduceerd om de drempeltemperaturen voor celapoptose en de dood na verschillende tijdstippen te bepalen.
De voordelen van deze methode zijn de precisie van de temperatuur en de tijd van verwarming, evenals het hoge rendement bij het verwarmen van cellen in een hele celcultuurschotel. Bovendien staat het in staat om te studeren met een grote variëteit aan temperaturen en tijdsduur, die goed gecontroleerd kan worden door een geautomatiseerd besturingssysteem.
Introduction
Het begrijpen van temperatuurafhankelijke celbiologische reacties is van groot belang voor succesvolle hyperthermiebehandelingen. Retinale laserfotocoagulatie met een thermische laser, gebruikt in oogheelkunde, is een van de meest opgestelde laserbehandelingen in de geneeskunde. Zichtbaar licht, meestal van groene tot gele golflengten, wordt gebruikt in retinale laserbehandeling. Het licht wordt sterk geabsorbeerd door de melanine in retinale pigmentepitheliale (RPE) cellen, die de buitenste celmonolaag van het netvlies vormen. Er is recente interesse geweest bij artsen en onderzoekers bij zeer zachte thermische bestraling (sub-zichtbare fotocoagulatie) als een nieuwe therapeutische strategie voor verschillende soorten retinale aandoeningen 1 , 2 . Naar aanleiding van deze trend is onze interesse in RPE-cellen onder lethal verwarmen onder nauwkeurige temperatuurregeling, een techniek genaamd temperatuurgestuurde fotothermische therapie (TC-PTT).
Recente optoAkoestische technologie van ons instituut heeft de real-time meting van temperatuurstijgingen op bestraalde plaatsen in het netvlies mogelijk gemaakt. Dit maakt het mogelijk om de temperatuur te verhogen tijdens bestraling 3 . Aangezien de sub-dodelijke hyperthermie op het retina, veroorzaakt door het verwarmen van RPE-cellen subletaal, niet eerder is overwogen door de onmogelijkheid om de temperatuur te meten en te reguleren, hebben de temperatuurafhankelijke celreacties van RPE-cellen na thermische laserbestraling Tot op heden zeer weinig bestudeerd. Bovendien is niet alleen het temperatuurverschil in detail besproken, maar ook het verschil in het celgedrag van de overlevende cellen na sublodale en dodelijke bestraling. Daarom, om wetenschappelijk bewijs op TC-PTT gebaseerde behandelingen te verzamelen, streven we ernaar om de temperatuurafhankelijke RPE-celbiologische reacties en hun mechanismen toe te lichten door gebruik te maken van in vitro experimentele opstellingen.
Voor tZijn doel is het opzetten van een celverwarmingsinstallatie die voldoet aan de volgende voorwaarden: 1) een mogelijkheid tot snelle temperatuurstijgingen, 2) een nauwkeurig geregelde tijd en temperatuur en 3) een relatief groot aantal onderzochte cellen voor biologische experimenten . Wat de verwarmingsmethode betreft, is een klinische laser, zoals een frequentieverdubbelde Nd.YAG laser (532 nm), helaas ongeschikt voor celcultuurverwarming. Dit komt door het sterk verminderde aantal melanosomen in gekweekte RPE cellen. De laserlichtabsorptie kan inhomogeen zijn, en de temperatuurstijging op het cellulaire niveau is variabel tussen experimenten, zelfs bij bestraling met dezelfde stralingskracht. Verscheidene eerdere studies hebben melding gemaakt van het gebruik van zwart papier onder de schotelbodem tijdens bestraling 4 of het gebruik van extra melanosomen die gefagocytiseerd zijn door de cultuurcellen voor de experimenten 5 , 6 . Veel vanDe in vitro biologische studies om hyperthermie geïnduceerde celreacties te beoordelen zijn uitgevoerd met behulp van een kookplaat, een waterbad of een CO 2- incubator met een temperatuurinstelling 7 . Deze methoden vereisen een lange verwarmingsperiode, omdat het enige tijd duren ( dwz enkele minuten) om de gewenste temperatuur te bereiken. Bovendien is het moeilijk om een gedetailleerde thermische geschiedenis ( dwz temperatuur vermenigvuldigd met de tijd) op het cellulaire niveau te verkrijgen door gebruik te maken van deze methoden. Bovendien kan de temperatuur tussen de cellen op verschillende posities in één kweekschotel verschillen door diffusie van variabele temperatuur. In de meeste gevallen is deze informatie over temporale en ruimtelijke temperatuur tijdens hyperthermie niet in aanmerking genomen voor biologische analyses, ook al kan de biologische celreactie kritisch beïnvloed worden door de temperatuur en de tijdsduur van de verhoogde temperatuur.
Om deze problemen te overwinnen, een contiNuuwe-golf thulium laser werd hier gebruikt om de cellen te verwarmen. Thulium laserstraling (λ = 1,94 μm) wordt sterk geabsorbeerd door water 8 , en de cellen aan de onderkant van de kweekschotel worden thermisch gestimuleerd uitsluitend door thermische diffusie. De laservezel met een diameter van 365 μm ligt ongeveer 12 cm boven de kweekschotel, zonder enige optica tussenin. De diameter van de laserstraal divergeert zodanig dat het bijna gelijk is aan de binnendiameter van de cultuurschotel (30 mm) op het oppervlak van het kweekmedium. Met een consistente hoeveelheid kweekmedium is het mogelijk om de cellen te irradieren met de temperatuurverhoging Van hoge herhaalbaarheid. Met variabele energie instellingen kunt u bestraling met maximaal 20 W, en de gemiddelde temperatuur op het cellulaire niveau worden verhoogd tot ΔT ≈ 26 ° C in 10 s.
Door de bestralingsomstandigheden te wijzigen is het ook mogelijk om het laserstraalprofiel te veranderen om de temperatuurverdeling te variërenOp in een cultuurschotel. Het is bijvoorbeeld mogelijk om met een Gauss-achtige temperatuurverdeling, zoals in de huidige studie, of met een homogene temperatuurdistributie te onderzoeken. Het laatste kan voordelig zijn voor het onderzoeken van de effecten van temperatuurafhankelijke celreacties, meer specifiek voor sublodale temperatuurstijgingen, maar niet voor celdoodspanning of wondgenezingsresponsen.
In totaal kan thuliumlaserbestraling het onderzoek mogelijk maken van verschillende soorten biologische factoren, zoals gen / eiwituitdrukking, celdoodkinetiek, cel proliferatie en ontwikkeling van celfunctionaliteit, na verschillende thermische blootstellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het bespreken van temperatuurgerelateerde biologische cellulaire reacties is niet alleen de temperatuur, maar ook de tijdsduur van de verhoogde temperatuur van belang, aangezien de meeste biochemische processen tijdafhankelijk zijn. Met name op het gebied van lasergeïnduceerde hyperthermie in oogheelkunde, door het korte tijdsbestek van milliseconden tot seconden, is het moeilijk om celthermische effecten te onderzoeken met precieze temperatuurregeling. Daarom is een laserbestralingsopstelling geschikt voor het cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbijdrage van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (subsidie # 13GW0043C) en en een Europees Bureau voor Ruimtevaart Onderzoek en Ontwikkeling (EOARD, subsidie # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Riferimenti
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
