Láser de Thulium de onda continua para calentar las células cultivadas para investigar los efectos térmicos celulares
Summary
Aquí se introduce una configuración experimental original para calentar células en un plato de cultivo usando radiación de láser de onda continua de 1,94 μm. Utilizando este método, se pueden investigar las respuestas biológicas de las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) después de diferentes exposiciones térmicas.
Abstract
Aquí se introduce un método original para calentar células cultivadas usando un láser de thulium de onda continua de 1,94 μm para la evaluación biológica. La radiación láser de túlio es fuertemente absorbida por el agua, y las células en el fondo del plato de cultivo son calentadas por difusión térmica. Una fibra láser con un diámetro de 365 μm se coloca aproximadamente a 12 cm por encima del plato de cultivo, sin ninguna óptica, de manera que el diámetro del haz de láser sea casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo (30 mm). Al mantener una cantidad constante de medio de cultivo en cada experimento, es posible irradiar las células con un aumento de temperatura altamente reproducible.
Para calibrar el aumento de temperatura y su distribución en un plato de cultivo celular para cada ajuste de potencia, se midió la temperatura durante 10 s de irradiación en diferentes posiciones ya nivel celular. La distribución de la temperatura se representó utilizando un software de gráficos matemáticosPrograma, y su patrón a través del plato de la cultura estaba en forma gaussiana. Después de la irradiación con láser, se pueden realizar diferentes experimentos biológicos para evaluar las respuestas celulares dependientes de la temperatura. En este manuscrito, se introduce la tinción de viabilidad ( es decir, distinguir las células vivas, apoptóticas y muertas) para ayudar a determinar las temperaturas umbral para la apoptosis celular y la muerte después de diferentes puntos en el tiempo.
Las ventajas de este método son la precisión de la temperatura y el tiempo de calentamiento, así como su alta eficiencia en células de calentamiento en un plato de cultivo de células enteras. Además, permite estudiar con una amplia variedad de temperaturas y duraciones de tiempo, las cuales pueden ser bien controladas por un sistema operativo computarizado.
Introduction
La comprensión de las respuestas biológicas celulares dependientes de la temperatura es de gran importancia para los tratamientos exitosos de hipertermia. La fotocoagulación láser retiniana con láser térmico, utilizada en oftalmología, es uno de los tratamientos con láser más establecidos en medicina. La luz visible, sobre todo de longitudes de onda verdes a amarillas, se utiliza en el tratamiento láser de la retina. La luz es altamente absorbida por la melanina en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE), que forman la monocapa celular más externa de la retina. Ha habido un interés reciente entre los médicos y los investigadores en la irradiación térmica muy leve (fotocoagulación sub-visible) como una nueva estrategia terapéutica para diferentes tipos de trastornos de la retina 1 , 2 . Siguiendo esta tendencia, nuestro interés está en calentar letalmente células RPE bajo un control preciso de la temperatura, una técnica llamada terapia fototérmica con temperatura controlada (TC-PTT).
Opto recienteAcústica de nuestro instituto ha permitido la medición en tiempo real de los aumentos de temperatura en los sitios irradiados en la retina. Esto permite controlar el aumento de la temperatura durante la irradiación 3 . Sin embargo, dado que la hipertermia sub-letal en la retina, causada por el calentamiento de las células RPE sub letalmente, no se ha considerado previamente debido a la imposibilidad de medir y controlar la temperatura, las respuestas celulares dependientes de la temperatura de las células RPE tras la irradiación con láser térmico Se ha estudiado muy poco hasta la fecha. Además, no sólo se ha discutido en detalle la diferencia de temperatura, sino también la diferencia en el comportamiento celular de las células supervivientes después de la irradiación letal y letal. Por lo tanto, para reunir evidencia científica sobre los tratamientos basados en TC-PTT, nuestro objetivo es elucidar las respuestas biológicas dependientes de la temperatura de las células de RPE y sus mecanismos utilizando configuraciones experimentales in vitro .
Para tSu propósito, es necesario establecer un sistema de calentamiento de células que cumpla con las siguientes condiciones: 1) una posibilidad de aumentos rápidos de temperatura, 2) un tiempo y temperatura controlados con precisión, y 3) un número relativamente alto de células examinadas para experimentos biológicos . Respecto al método de calentamiento, un láser clínico, tal como un láser Nd.YAG de frecuencia doble (532 nm), desafortunadamente no es adecuado para el calentamiento del cultivo celular. Esto es debido al número fuertemente reducido de melanosomas en células RPE cultivadas. La absorción de la luz láser puede ser heterogénea, y el aumento de la temperatura a nivel celular es variable entre los experimentos, incluso cuando se irradia con la misma potencia de radiación. Varios estudios anteriores han informado sobre el uso de papel negro bajo el fondo del plato durante la irradiación 4 o el uso de melanosomas adicionales que son fagocitados por las células de cultivo antes de los experimentos 5 , Muchos deLos estudios biológicos in vitro para evaluar las respuestas de células inducidas por hipertermia se han realizado utilizando una placa caliente, un baño de agua o una incubadora de CO 2 con un ajuste de temperatura 7 . Estos métodos requieren un largo período de calentamiento porque lleva algún tiempo ( es decir, varios minutos) alcanzar la temperatura deseada. Además, utilizando estos métodos, es difícil obtener un historial térmico detallado ( es decir, la temperatura multiplicada por el tiempo) a nivel celular. Además, la temperatura entre las células en diferentes posiciones en un plato de cultivo puede diferir debido a la difusión de temperatura variable. En la mayoría de los casos, esta información de temperatura temporal y espacial durante la hipertermia no ha sido tomada en consideración para los análisis biológicos, aunque la respuesta celular biológica puede ser afectada críticamente por la temperatura y la duración del tiempo de aumento de la temperatura.
Para superar estos problemas,El láser de thulium de onda nuous se usó aquí para calentar las células. La radiación láser de thulium (λ = 1,94 μm) es fuertemente absorbida por el agua 8 , y las células en el fondo del plato de cultivo son estimuladas térmicamente únicamente por difusión térmica. La fibra láser con un diámetro de 365 μm se coloca alrededor de 12 cm por encima del plato de cultivo, sin ninguna óptica entre ellas. El diámetro del haz láser diverge de tal manera que es casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo (30 mm) en la superficie del medio de cultivo. Con una cantidad constante de medio de cultivo, es posible irradiar las células con el aumento de temperatura De alta repetibilidad. Los ajustes de potencia variable permiten la irradiación con hasta 20 W, y la temperatura del medio en el nivel celular puede aumentarse hasta ΔT ≈ 26 ° C en 10 s.
Mediante la modificación de las condiciones de irradiación, también es posible cambiar el perfil del haz de láser para variar la distribución de la temperaturaEn un plato de cultivo. Por ejemplo, es posible investigar con una distribución de temperatura de tipo gaussiano, como en el presente estudio, o con una distribución de temperatura homogénea. Este último puede ser ventajoso para investigar los efectos de las respuestas celulares dependientes de la temperatura más específicamente para aumentos de temperatura sub-letales, pero no para el estrés por muerte celular o las respuestas de cicatrización de heridas.
En conjunto, la irradiación láser de thulium puede permitir la investigación de diferentes tipos de factores biológicos, como la expresión de genes / proteínas, la cinética de muerte celular, la proliferación celular y el desarrollo de la funcionalidad celular, después de diferentes exposiciones térmicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al discutir las respuestas celulares biológicas relacionadas con la temperatura, no sólo la temperatura, sino también la duración del tiempo de aumento de la temperatura, es importante, ya que la mayoría de los procesos bioquímicos son dependientes del tiempo. Particularmente en el campo de la hipertermia inducida por láser en oftalmología, debido al corto intervalo de tiempo -desde milisegundos a segundos- es difícil investigar los efectos térmicos celulares con un control preciso de la temperatura. Por lo ta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de investigación del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (subvención # 13GW0043C) y una Oficina Europea de Investigación y Desarrollo Aeroespacial (EOARD, beca # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Riferimenti
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