العمل مع الخلايا السمعية مؤسسات التعليم العالي-OC1
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
منزل الأذن معهد-الجهاز كورتي 1 تستمد (HEI-OC1) خلايا من الجهاز السمعي من 1،2 الماوس المعدلة وراثيا. حضانة أي خلية من هذا الفأر وراثيا في 33 ° C / 10٪ CO 2 (شروط متساهلة) يستحث تعبير عن الجينات تخليد الذي يقوم بتشغيل دي التمايز وتسارع انتشار. تحريك الخلايا إلى 39 ° C / 5٪ CO 2 (ظروف غير متساهلة) تؤدي إلى انخفاض انتشار، والتمايز، وعلى الأقل في حالة من مؤسسات التعليم العالي-OC1، موت الخلايا 2،3.
تم استنساخ خلايا التعليم العالي-OC1 وتميزت في المختبر لدينا منذ أكثر من عشر سنوات، وأشارت الدراسات الأولية أنها تعبير عن علامات معينة من خلايا الشعر قوقعة، مثل prestin، الميوسين 7A، Atoh1، عامل التغذية العصبية، calbindin وكالمودولين، ولكن أيضا علامات من دعم خلايا مثل connexin 26 و نمو الخلايا الليفية مستقبلات عامل (جمعية جيل المستقبل-R) 2. لذلك، اقترح أن مؤسسات التعليم العالي-OC1 يمكن أن تمثل commoن السلف للخلايا الحسية ودعم من جهاز كورتي 2. قدمت دراسات موازية أدلة قوية على أن التوراتية المخدرات السامة مثل سيسبلاتين، جنتاميسين والستربتومايسين التي يسببها كاسباس 3 التنشيط في هذه الخلايا، في حين لم المخدرات تعتبر غير سامة للأذن، مثل البنسلين، وليس 2،3. لذلك، اقترح هذا الخط الخلية كنظام في المختبر للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية تشارك في تسميم أذني وللفحص من احتمال التسمم الأذني أو خصائص otoprotective العقاقير الدوائية الجديدة. وتشير التقديرات إلى أن الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 استخدمت في أكثر من مائة وخمسين دراسة نشرت في السنوات العشر الماضية.
في حين تبحث في التأثير المحتمل الموالية لأفكارك من الأدوية المختلفة كان الهدف الرئيسي لمعظم الدراسات التي تنطوي على هذا الخط الخلية، عمليات الخلية الهامة الأخرى مثل الالتهام الذاتي والشيخوخة قد بدأت لتوها إلى التحقيق في زنازين مؤسسات التعليم العالي-OC1 4-7. أنانا دراسة حديثة من مختبرنا 8، استخدمنا خلايا التعليم العالي-OC1 لجمع مجموعة شاملة من البيانات عن موت الخلايا والبقاء والانتشار، الشيخوخة والالتهام الذاتي الناجم عن العقاقير الدوائية المختلفة التي يكثر استخدامها في العيادة. نحن أيضا مقارنة بعض استجابات الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 مع تلك من كلوة-293 (خلايا الكلى الجنينية البشرية) وهيلا (خلايا الظهارية البشرية) يتلقون العلاج متطابقة. وأشارت النتائج التي توصلنا إليها خلايا التعليم العالي-OC1 تستجيب إلى كل دواء بطريقة مميزة، مع dose- مميزة والحساسية تعتمد على الوقت واحدة على الأقل من آليات قيد الدراسة. أكدنا أيضا في هذه الدراسة أن التفسير الصحيح للنتائج التجريبية سوف يتطلب إجراء دراسات موازية مع تقنية أكثر من 8.
وفي دراسة مختلفة ونحن التحقيق في استخدام الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 لتقييم الاستجابة الوظيفية لprestin، البروتين السيارات من خلايا الشعر الخارجي قوقعة (OHCs) 9 </sتصل>. أبلغنا التدفق الخلوي ودراسات المسح المجهري ليزر متحد البؤر على نمط من التعبير prestin، وكذلك السعة غير الخطية (NLC) والدراسات لقط خلية التصحيح كلها في الخلايا مؤسسات التعليم العالي-OC1 مثقف في متساهلة (P-HEI-OC1) وغير متساهلة (NP-HEI-OC1) الظروف. وأشارت النتائج التي توصلنا إليها كل من إجمالي التعبير prestin وغشاء البلازما زيادة توطين بطريقة تعتمد على الوقت في الخلايا NP-HEI-OC1. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أيضا أن الزيادة في توطين prestin في الغشاء البلازمي للخلايا NP-HEI-OC1 المترابطة مع انخفاض في نا + K + أتباز، التي translocated من غشاء البلازما إلى السيتوبلازم دون تغييرات كبيرة في إجمالي التعبير الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن الخلايا P-HEI-OC1 لها مؤتمر العمل النيجيري القوي المرتبطة prestin الوظائف الحركية، والتي انخفضت عندما زادت كثافة جزيئات prestin الحاضرة في غشاء البلازما. وإجمالا، فإن هذه النتائج تدعم بقوة فائدة مؤسسات التعليم العالي-OC1 خلايا للتحقيق البروتينات السمعية.
في هذه المقالة الفيديو وصفنا كيفية الثقافة خلايا التعليم العالي-OC1، لماذا أنها مريحة لاستخدام خلايا تنمو في الظروف متساهلة (P-HEI-OC1) للدراسات السمية الخلوية، وكيفية تقييم آلية / ثانية للخلايا المخدرات التي يسببها وكيف إجراء دراسات الكهربية (على سبيل المثال، والتصحيح، المشبك، والسعة غير الخطية (NLC)) للتحقيق في الخصائص الفنية للprestin، المحرك الجزيئي للOHCs القوقعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير وصفنا كيفية الثقافة خلايا التعليم العالي-OC1 واستخدامها لتقييم آليات للخلايا المخدرات التي يسببها والتحقيق في الخصائص الفنية للprestin، المحرك الجزيئي للقوقعة OHCs. الإجراءات الفنية، ومع ذلك، فإن العام بما فيه الكفاية لتتكيف بسهولة مع مختلف الدراسات.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
