Работа с Слуховой HEI-OC1 клеток
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
Дом Ухо институт-кортиева органа 1 (HEI-OC1) клетки получают из слухового органа трансгенной мыши 1,2. Инкубационный любой клетки от этой трансгенной мыши при 33 ° C / 10% CO 2 (разрешающих условиях) индуцирует экспрессию гена увековечивающему, запускающего де-дифференциацию и пролиферацию ускоренную; перемещение клеток до 39 ° C / 5% CO 2 (не разрешающие условия) приводят к снижению пролиферации, дифференцировки и, по крайней мере , в случае Hei-OC1, гибели клеток 2,3.
Вуз-OC1 клетки были клонированы и охарактеризованы в нашей лаборатории более десяти лет назад, и первоначальные исследования показали, что они выражают специфические маркеры волосковых клеток улитки, такие как Prestin, миозина 7а, Atoh1, BDNF, кальбиндин и кальмодулин, но и маркеры поддержки клетки , такие как коннексина 26 и рецептора фактора роста фибробластов (FGF-R) 2. Поэтому было высказано предположение о том, что HEI-OC1 может представлять собой Коммоп прародителем для сенсорных и опорных клеток органа Корти 2. Параллельные исследования убедительно показали , что архетипическом ототоксичен препараты , как цисплатин, гентамицин и стрептомицин индуцированной активации каспазы-3 в этих клетках, в то время как препараты считаются не ототоксичен, как пенициллин, не сделал 2,3. Таким образом, эта клеточная линия была предложена в качестве системы в пробирке для исследования клеточных и молекулярных механизмов , участвующих в ототоксичность и для скрининга потенциальных ототоксичность или otoprotective свойств новых фармакологических препаратов. Предполагается, что HEI-OC1 клетки были использованы в более чем ста пятидесяти исследований, опубликованных за последние десять лет.
Принимая во внимание , глядя на потенциального проапоптотического влияния различных препаратов была основной целью большинства исследований , связанных с этой клеточной линии, другие важные клеточные процессы , такие как аутофагии и старении только начали исследовать в клетках HEI-OC1 4-7. яна недавнем исследовании нашей лаборатории 8, мы использовали клетки HEI-OC1 собрать полный набор данных о гибели клеток, выживание, пролиферацию, старении и аутофагии , вызванных различными фармакологическими препаратами , часто используемых в клинике. Мы также сравнили некоторые из ответов HEI-OC1 клеток с теми из НЕК-293 (эмбриональные клетки почки человека) и HeLa (эпителиальные клетки человека), получающих идентичную обработку. Наши результаты показали, что Hei-OC1 клетки реагируют на каждого лекарственного средства характерным образом, с характерным дозы и времени зависит чувствительность, по крайней мере, один из механизмов, на стадии изучения. Мы также подчеркнули , в этом исследовании , что правильная интерпретация экспериментальных результатов потребует проведения параллельных исследований с более чем одной техники 8.
В другом исследовании мы изучали использование клеток HEI-OC1 оценить функциональную характеристику Prestin, двигатель белок кохлеарных наружных волосковых клеток (OHCs) 9 </sвверх>. Мы сообщили проточной цитометрии и конфокальной микроскопии исследования лазерного сканирования по образцу Prestin выражения, а также нелинейной емкости (НЖК) и целые исследования прижимных клеток патч в Вуз-OC1 клеток, культивируемых в разрешительный (P-Hei-OC1) и не- разрешающие (NP-вуз-OC1) условиях. Наши результаты показали, что как общее выражение Prestin и плазмалеммы увеличение локализации в зависимости от времени в клетках NP-Вуз-OC1. Интересно отметить , что мы также обнаружили , что увеличение Prestin локализации в плазматической мембране клеток NP-Hei-OC1 коррелировало с уменьшением Na + K + АТФазы, которая транслокации из плазматической мембраны в цитоплазму без существенных изменений в общей экспрессии в клетках. Кроме того, мы показали, что Р-Вуз-OC1 клетки имеют надежный НЖК, связанный с Prestin двигательной функции, которая уменьшается, когда плотность молекул Prestin, присутствующих на мембране увеличена. В целом, эти результаты убедительно подтверждают полезность Hei-OC1 клетки для исследования слуховых белков.
В этом видео статье мы опишем, как культура клеток HEI-OC1, почему удобно использовать клетки растут в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) для исследований цитотоксичности, как оценить механизм / с лекарственно-индуцированной цитотоксичности и как для выполнения электрофизиологических исследований (например, патч-зажим, нелинейную емкость (НЖК)) для исследования функциональных свойств Prestin, молекулярного двигателя кохлеарного OHCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом докладе мы опишем, как культура клеток HEI-OC1 и использовать их для оценки механизмов цитотоксичности медикаментозного и исследовать функциональные свойства Prestin, молекулярного двигателя кохлеарной OHCs. Технические процедуры, однако, являются достаточно общими, чтобы быть легко а…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
