Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3.
células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos.
Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8.
Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 </s-se>. Nós relatamos citometria de fluxo e estudos de microscopia confocal de varredura a laser sobre o padrão de expressão prestin, bem como capacitância não-linear (NLC) e os estudos de fixação de células-remendo inteiros em células HEI-OC1 cultivadas na permissiva (P-HEI-OC1) e não permissivas (NP-HEI-OC1) condições. Os nossos resultados indicaram que tanto o aumento total de localização expressão prestin e membrana de plasma de uma maneira dependente do tempo em células NP-Hei-OC1. Curiosamente, também descobrimos que o aumento na localização prestin na membrana plasmática de células NP-Hei-OC1 correlacionada com uma diminuição em Na + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas.
Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos.
Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
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