Werken met Auditieve HEI-OC1 Cells
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
Huis Ear Institute-orgaan van Corti 1 (HEI-OC1) cellen afkomstig van het auditieve orgaan van een transgene muis 1,2. Incubatie van een cel van deze transgene muizen bij 33 ° C / 10% CO 2 (permissieve omstandigheden) induceert expressie van een gen dat het onsterfelijk de-differentiatie en proliferatie versnelde triggers; het verplaatsen van de cellen 39 ° C / 5% CO 2 (non-permissie-omstandigheden) daalt de proliferatie, differentiatie en, althans bij HEI-OC1, celdood 2,3.
HEI-OC1 cellen werden gekloneerd en gekarakteriseerd in ons laboratorium tien jaar geleden en initiële studies aantonen dat specifieke merkers van cochleaire haarcellen, zoals prestin, myosine 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin en calmoduline, maar ook markers ondersteunen drukken cellen zoals connexine 26 en fibroblast growth factor receptor (FGF-R) 2. Daarom werd gesuggereerd dat HEI-OC1 een commo kunnen vertegenwoordigenn progenitor voor sensorische en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti 2. Parallel studies levert sterke aanwijzingen dat ototoxic drugs zoals cisplatine, gentamicine en streptomycine geïnduceerde caspase-3-activering in deze cellen archetypische, terwijl de drugs beschouwd als niet-ototoxische, zoals penicilline, niet 2,3. Daarom werd deze cellijn voorgesteld als een in vitro systeem om de cellulaire en moleculaire mechanismen ototoxiciteit en voor het screenen van potentiële ototoxiciteit of otoprotective eigenschappen van nieuwe farmacologische middelen te onderzoeken. Geschat wordt dat HEI-OC1 cellen zijn in meer dan honderdvijftig studies gepubliceerd in de afgelopen tien jaar.
Dat waarbij de mogelijkheden pro-apoptotisch effect van verschillende geneesmiddelen was de belangrijkste doel van de meeste onderzoeken met deze cellijn zijn andere belangrijke celprocessen zoals autofagie en senescentie net begonnen te onderzoeken in HEI-OC1 cellen 4-7. ikna recent onderzoek van ons laboratorium 8, gebruikten we HEI-OC1 cellen om een uitgebreide set van gegevens over celdood, overleving, proliferatie, veroudering en autofagie veroorzaakt door verschillende farmacologische drugs vaak gebruikt in de kliniek te verzamelen. We vergeleken ook enkele van de reacties van HEI-OC1 cellen met die uit HEK-293 (humane embryonale niercellen) en HeLa (menselijke epitheelcellen) die een identieke behandeling. Onze resultaten gaven aan dat HEI-OC1 cellen reageert op elk geneesmiddel op karakteristieke wijze, met een kenmerkende dosis- en tijdsafhankelijke gevoeligheid voor ten minste één van de mechanismen van de studie. Ook benadrukt dat onderzoek dat een correcte interpretatie van de experimentele resultaten vereist uitvoeren parallel onderzoek met meerdere techniek 8.
In een andere studie onderzochten we het gebruik van HEI-OC1 cellen de functionele respons van prestin, de motor eiwit van cochleaire buitenste haarcellen (OHCS) 9 evalueren </sup>. We meldden flow cytometrie en confocale laser scanning microscopie studies op het patroon van expressie prestin, alsmede lineaire capaciteit (NAR) en volledige cel-patchklemmen studies in HEI-OC1 cellen gekweekt bij permissieve (P-HEI-OC1) en niet- tolerante (NP-HEI-OC1) omstandigheden. Onze resultaten gaven aan dat zowel de totale prestin expressie en plasmamembraan lokalisatie toename van een tijdsafhankelijke wijze NP-HEI-OC1 cellen. Interessant, vonden we ook dat de toename prestin lokalisatie op het plasmamembraan van NP-HEI-OC1 cellen correleerde met een vermindering van Na + K + ATPase, die translocatie van het plasmamembraan naar het cytoplasma zonder significante veranderingen in de totale cel expressie. Bovendien hebben we aangetoond dat P-HEI-OC1 cellen een sterke NAR geassocieerd motorfunctie die af wanneer de dichtheid van prestin moleculen aanwezig in het plasmamembraan toegenomen Prestin. In totaal hebben deze resultaten een groot voorstander van het nut van HEI-OC1 cellen auditieve eiwitten te onderzoeken.
In deze video artikel beschrijven we hoe de cultuur HEI-OC1 cellen, waarom is het handig om cellen te gebruiken groeien in permissieve omstandigheden (P-HEI-OC1) voor cytotoxiciteit studies, hoe het mechanisme / s van geneesmiddel-geïnduceerde cytotoxiciteit en hoe evalueren om elektrofysiologische studies uit te voeren (bijvoorbeeld patch-clamp, niet-lineaire capaciteit (NLC)) naar functionele eigenschappen van prestin, de moleculaire motor van cochleaire OHCS onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport beschrijven we hoe de cultuur HEI-OC1 cellen en ze gebruiken om mechanismen van geneesmiddel-geïnduceerde cytotoxiciteit te evalueren en functionele eigenschappen van prestin, de moleculaire motor van cochleaire OHCS onderzoeken. De technische procedures zijn echter algemeen genoeg om gemakkelijk worden aangepast aan verschillende onderzoeken.
Al de hier beschreven protocollen vereisen het juiste gebruik van gevestigde celcultuur technieken 10. Net als bij alle and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
- Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
- Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
- Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
- Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
- Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
- Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
- Celis, J. E. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).
- Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
- Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
- Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
- Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
- Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
- Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
- Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin’s Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
- Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).
