श्रवण Hei-OC1 कोशिकाओं के साथ काम
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
कोर्टी 1 की सभा कान संस्थान अंग (Hei-OC1) कोशिकाओं एक ट्रांसजेनिक माउस 1,2 के श्रवण अंग से निकाली गई है। 33 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 (अनुमोदक की स्थिति) पर इस ट्रांसजेनिक माउस से किसी भी सेल की ऊष्मायन एक immortalizing जीन है कि चलाता de-भेदभाव और त्वरित प्रसार की अभिव्यक्ति लाती है; 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 (गैर अनुमोदक की स्थिति) का नेतृत्व प्रसार, भेदभाव में कमी आई है और कम से कम Hei-OC1, कोशिका मृत्यु 2,3 के मामले में, के लिए कोशिकाओं बढ़ रहा है।
Hei-OC1 कोशिकाओं क्लोन और एक दशक पहले हमारी प्रयोगशाला में विशेषता थे, और प्रारंभिक अध्ययनों से संकेत दिया है कि वे इस तरह के prestin, मायोसिन 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin और calmodulin के रूप में कर्णावत बालों की कोशिकाओं, के विशिष्ट मार्कर, लेकिन यह भी समर्थन करने का मार्करों व्यक्त connexin 26 और fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर (FGF-R) 2 कोशिकाओं की तरह। इसलिए, यह सुझाव दिया गया था कि Hei-OC1 एक commo का प्रतिनिधित्व कर सकताकोर्टी 2 के अंग का संवेदी और समर्थन कोशिकाओं के लिए N पूर्वज। समानांतर पढ़ाई के मजबूत सबूत है कि सिस्पैटिन, जेंटामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन इन कोशिकाओं में प्रेरित कस्पासे 3 सक्रियण जैसी ototoxic दवाओं ठेठ है, बशर्ते जबकि दवाओं गैर ototoxic माना जाता है, पेनिसिलिन की तरह, 2,3 नहीं किया। इसलिए, इस सेल लाइन इन विट्रो प्रणाली ototoxicity में और संभावित ototoxicity या नए औषधीय दवाओं के otoprotective संपत्तियों की जांच के लिए शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के रूप में प्रस्तावित किया गया था। यह अनुमान है कि Hei-OC1 कोशिकाओं पिछले दस वर्षों में प्रकाशित एक से अधिक एक सौ और पचास के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है।
जबकि विभिन्न दवाओं के संभावित समर्थक apoptotic प्रभाव पर विचार कर रही इस सेल लाइन को शामिल अध्ययन के सबसे का प्रमुख लक्ष्य था, भोजी और वार्धक्य जैसे अन्य महत्वपूर्ण सेल प्रक्रियाओं सिर्फ Hei-OC1 कोशिकाओं 4-7 में जांच की जा शुरू कर दिया है। मैंna हमारी प्रयोगशाला 8 से हाल के एक अध्ययन में, हम Hei-OC1 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया कोशिका मृत्यु, अस्तित्व, प्रसार, वार्धक्य और भोजी विभिन्न औषधीय दवाओं अक्सर क्लिनिक में इस्तेमाल से प्रेरित बारे में डेटा की एक व्यापक सेट इकट्ठा करने के लिए। हम यह भी (मानव उपकला कोशिकाओं) HEK-293 (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं) और हेला से उन लोगों के लिए समान उपचार प्राप्त करने के साथ Hei-OC1 कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं में से कुछ की तुलना में। हमारे परिणाम संकेत दिया कि Hei-OC1 कोशिकाओं अध्ययन के तहत तंत्र के कम से कम एक के लिए एक विशिष्ट खुराक और समय पर निर्भर संवेदनशीलता के साथ एक विशेषता रास्ते में प्रत्येक दवा का जवाब है,। हम यह भी है कि अध्ययन है कि प्रयोगात्मक परिणामों की सही व्याख्या एक से अधिक तकनीक 8 के साथ समानांतर पढ़ाई के प्रदर्शन की आवश्यकता होगी में बल दिया।
एक अलग अध्ययन में हम Hei-OC1 कोशिकाओं के उपयोग की जांच की prestin के कार्यात्मक प्रतिक्रिया, कर्णावत बाहरी बालों की कोशिकाओं की मोटर प्रोटीन (OHCs) 9 मूल्यांकन करने के लिए </s> अप। हम प्रवाह cytometry और Hei-OC1 कोशिकाओं अनुमोदक (पी-Hei-OC1) और गैर पर सुसंस्कृत में prestin अभिव्यक्ति के पैटर्न, साथ ही nonlinear समाई (एनएलसी) और पूरे सेल पैच clamping पढ़ाई पर लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग अध्ययनों की रिपोर्ट अनुमोदक (एनपी Hei-OC1) की स्थिति। हमारे परिणाम संकेत दिया कि दोनों कुल prestin अभिव्यक्ति और प्लाज्मा झिल्ली एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं में एक समय पर निर्भर ढंग से स्थानीयकरण वृद्धि हुई है। दिलचस्प बात यह है कि हम यह भी पाया कि ना + K + ATPase में कमी है, जो कुल सेल अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना कोशिका द्रव्य के लिए प्लाज्मा झिल्ली से translocated के साथ सहसंबद्ध एनपी Hei-OC1 कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर prestin स्थानीयकरण में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि पी-Hei-OC1 कोशिकाओं को एक मजबूत एनएलसी मोटर समारोह है, जो जब प्लाज्मा झिल्ली में उपस्थित prestin अणुओं के घनत्व में वृद्धि हुई कमी आई है prestin से जुड़े हुए है। कुल मिलाकर, इन परिणामों जोरदार Hei-ओसी की उपयोगिता का समर्थन1 कोशिकाओं श्रवण प्रोटीन की जांच करने के लिए।
इस वीडियो लेख में हम कैसे संस्कृति Hei-OC1 कोशिकाओं, क्यों यह cytotoxicity अध्ययन के लिए (पी-Hei-OC1) अनुमोदक की स्थिति में बढ़ कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है, कैसे दवा प्रेरित cytotoxicity और कैसे की व्यवस्था / एस का मूल्यांकन करने का वर्णन electrophysiological अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए (जैसे, पैच दबाना, गैर रेखीय समाई (एनएलसी)) prestin, कर्णावत OHCs की आणविक मोटर के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में हम कैसे संस्कृति Hei-OC1 कोशिकाओं को वर्णन है और दवा प्रेरित cytotoxicity के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं और prestin, कर्णावत OHCs की आणविक मोटर के कार्यात्मक गुणों की जांच करने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
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